Cortando o presunto

Nesta terça eu e a Cíntia fizemos alguns cortes do meu material para a microscopia eletrônica de transmissão (MET, em português e TEM em inglês). Até que foi bem rápido, pois a pirâmide do bloco já estava "no ponto" pra corte (quando fazemos um bloco novo, temos que ir cortando a pontinha deste bloco, feito de resina, em um formato triangular, bem pequenininho. Então esta pontinha é cortada com uma faca e$pecial, de diamante). Então foi só encaixar as peças e deixar a máquina fazer o resto - ainda bem que é automática). Os cortes, acolhidos em uma banheira com água, estavam muito bons, bem dourados. A cor indica o quão fino o corte está, e a cor dourada de ser um corte de 0,2 micrômetros. Se estiver púrpura, por exemplo, tá grosso demais para a MET, pois o feixe de elétrons do aparelho não conseguiria atravessar o corte.

O triste depois é pescar os cortes. Tem uma gradezinha especial (usamos de cobre) onde colocamos o material. Mas primeiro, temos que dar um mergulhinho no ác. nítrico, para retirar possíveis gorduras - senão o corte não gruda). Mas esse banho tem que ser um mergulhinho, e rapidamente lavar com água: ou então não há mais grade :D, como aconteceu com a Paula rs.

Acho que pior que pescar é separar os cortes entre si. Imagina: você vai fatiar uma peça de presunto. faz a primeira fatia, e chega a peça para o lado; faz a segunda fatia, que fica parcialmente sobre a primeira, e assim vai, até formar uma fileira grande. Agora, você precisa colocar estes presuntos fatiados em uma tábua, mas a fileira que vc fez ficou grande demais. O que faz? corta o pedaço da fileira que caiba na tábua. É isso que tem que fazer: dos cortes seriados, tenho que separar um pedaço que caiba na grade. Simples, mas o problema é que os cortes, ultrafinos, estão boiando na água, e se pressioná-los demais eles afundam. E não é nada fácil desgrudá-los...deveria ter uns, sei lá, quase 80 cortes e fiz 5 grades com 4 cortes cada. Ou seja, dos 80, aproveitei 20, sendo que a maioria afundei rsE depois de pescados os cortes, as grades vão para o...porta-grades. Uma caixinha com vários buraquinhos numerados para guardar os cortes até a hora de usarmos...

Sydney rock oyster (Saccostrea glomerata) hemocytes: Morphology and function

Bom, como prometido, um apanhado desse artigo. Gostei dele pq ele fala sobre muitas das minhas dúvidas.
OBJETIVO: S. glomerata é uma das espécies mais importantes cultivadas em aquacultura, e é atacada por uma variedade de doenças infecciosas e infestação de parasitas. E os hemócitos participam de importantes vias de respostas imunes contra estes agentes infecciosos. Além disso, o estresse ambiental nas suscetibilidade e influência nas respostas imunológicas dos hemócitos contra tais os agentes. Sabe-se que temperatura, salinidade e poluentes químicos alteram as atividades dos hemócitos, e estes fatores podem aumentar a suscetibilidade das ostras a infecções. (TRADUÇÃO LIVRE DO ARTIGO)

Na literatura, é muito controversa a classificação dos hemócitos - pra invertebrado td é mais difícil. Mas é concenso que há pelo menos dois tipos padrão: os granulócitos - que possuem grânulos no citoplasma - e hialinócitos - que não os possuem, ou em quantidade muito reduzida. E dentro desss dois tipos é que as classificações podem variar, de acordo com a técnica empregada. neste artigo o autor usou algumas técnicas para criar classificações, baseada na morfologia (em microscopia de luz, de transmissão, de varredura) acido- ou basofilicidade dos grânulos ou citoplasma, tamanho e quantidade de grânulos, etc.

* Para caracterização, ele lançou mão das seguintes técnicas:

1) Separação dos hemócitos por M.O. (contraste de fase interferencial; “time-lapse photophotomicroscopy, que deve ser um aparelho fodástico, que ele tira fotos a cada 5s.)

2) coloração Giemsa/ May-grünwald

3) citometria de fluxo (site óootemo que achei pois ficava quebrando a cabeça de como o citômetro dava o tam. e a quantidade de grânulos nas células)

4) TEM (transmition electron microscopy)
5) SEM (scanning electron microscopy)

* além da caracterização morfológica, o autor também verificou a atividade fagocítica dos hemócitos, empregando os seguintes métodos:

- Imunohistoquímica para detecção de:

1) fosfatase ácida
2) peroxidase
3) fenoloxidase
4) superoxido
5) melanina

* Segundo o artigo, estas substâncias quando presentes no hemócito indicam se ocorre alguma atividade fagocítica. Peroxidade e fenoloxidade, por exemplo, estão presentes nos lisossomos, ou seja, atua como enzimas digestivas.

- Atividade fagocítica:

1) com S. cerevisae corado com vermelho congo

2) encapsulação com hifa de fungo

RESULTADOS

* para microscopia de luz:

Figura 1: Hemócitos em microscopia de luz e C de fase interferencial. Em A, temos a hemoblasto-like. Em B, hialinócito. Em C, granulócito. Em G, um agregado de cél, que graças a Deus ñ tenho visto muito nestas placas que ando fazendo, pois antes tinha muuuito deste tipo. quando tem, são de poucas células. em H, granulócito degranulado.

Abaixo, uma tabela resumida com as características que ele deu para cada cél:

Tabela 1: resumo da microscopia de luz

Graças ao aparelho que tira foto a cada 5s, eles verificaram que quem inicia a formação destes agregados são os hialinócitos, formando agregados pequenos, que aumentam de tamanho, e então "chama junto" os granulócitos, que começam a degranular!!! Logo pensaria: "ah, então os que se acham que é hialinócitos nada mais são que os granulócitos s/ grânulos..." nãaaao! eles viram q são hialinócitos sim. E como degranula? Os granulócitos formam vacúolos e encaminham seus grânulos para dentro destes vacúolos. E em alguns minutos tudo desaparece misteriosamente....rs


A Barracco já havia me falado que o granulócito de C. rhizophorae degranula. Eu também suspeito que uns pontinhos bem pequenininhos que vejo nas minhas placas sejam grânulos dos granulócitos. Mas uma foto tão bacana quanto a H...

Outra coisa que me surpreendeu: granulócito com auto-fluorescência em UV (figuras E e F)! Vai, por essa vc ñ esperava, ñ é?

Figura 2: Granulócitos sob luz UV

* Para citometria de fluxo:

Sobre citometria de fluxo, ele utilizou 5 individuos. Encontrou uma variabildade alta, mas pôde-se distinguiur basicamente 4 populações.
Em algumas ostras foram encontrados apenas R1 e R2, enquanto que em outras, foram encontrados todas as subpopulações. Ao observarem no microscópio, confirmou-se que R1 são granulócitos e R2, hialinócitos. Já R3 e R4 não puderam ser eficientemente classificados devido ao baixo número de células por região.

Abaixo, um resumo:

Tabela 2: Diferentes subpopulações de hemócitos classificados por citometria de fluxo

* Para Imunocitoquímica:

baixo, uma tabelinha resumida. As fotos estão bem bacanas, mas não vou adicioná-las aqui pois vai ficar imenso o post.

Tabela 3: Imunohistoquímica

Ou seja, todas as imunos deram positivas para todas as substâncias em granulócitos. Como eles fagocitam mais ativamente, há maior produção destas enzimas (fosfatase ácida, peroxidase, fenoloxidade) além de superóxido e melanina, todos envolvidos em processos de degração de corpos estranhos fagocitados por eles. Provavelmente por fagocitar menos, hialinócito deve não produzir, ou melhor, produzir quantidades muito pequenas destas enzimas.

FAGOCITANDO...

O autor viu que tanto granulócitos quanto hialinócitos tem habilidade de fagocitar, neste experimento ele utilizou o fungo C. cerevisae (péssimas lembranças...rs), sendo os granulócitos mais eficientes - teve um lá que fagocitou até 30 céls! Uma diferença interessante: os granulócitos não emitem filopódios para fagocitar ( ou então filopódios muito curtos): eles "engolfam" (verbo do artigo - engulfed) por invaginação da membrana. Já os hialinócitos emitem looongos filopódios.

Os granulócitos também encapsulam hifas (este processo ocorre qd a partícula estranha é mt maior que a célula). Alguns granulócitos ficaram em torno da hifa, e antes mesmo de ter algum contato, alguns degranularam. e no final de 40min, todos q estaavam participando do processo degranularam. No entanto, os hialinócitos pouco participaram deste processo. E também fizeram uma coloração para verificar a melanização destas cápsulas. Após uma pesquisa rápida no Oráculo - em fontes confiáveis, claro), a melanização ocorre após a ativação da cascata de fenoloxidase (PO), e este processo é uma resposta do sistema imune que também ocorre em vários outros invertebrados.

* Para TEM

Agora vamos p/ parte que interessa. Na TEM, ele divide os hemócitos em váaarios subtipos (4 sub- p/ hialinócitos e 5 sub- p/ granulócitos) baseados na razão citoplasma:núcleo (C:N), formato do núcleo, se forma ou não filopódio, se tem retículo (aliás aquelas "minhoquinhas" q a cíntia tinha falado q era reciclagem de membrana tá com cara de ser retículo...) , etc. e os grânulos? OITO tipos diferentes... e o autor hipotetiza queestes diferentes tipos de hemócitos podem ser diferentes estágios de uma via de maturação destas células, ou que simplesmente são mudanças súbitas individuais - sem via nenhuma. Já os OITO tipos de grânulos, ele diz que não está claro do porquê desta diversidade, mas que é frequentemente encontrado em outros bivalves. E pode ser que cada tipo de grânulo seja especializado em uma específica via de defesa na célula.

Mas eu acho que o técnico lá da uerj tava com razão...ficou pouco contrastado, em comparação com as microfotos do artigo

That´s all, folks!

"O" artigo

Algumas semanas atrás fui no MET da uerj com a Silvana e a Cíntia para finalmente ver nosso material – os meus hemócitos da C. rhizophorae e os hemócitos da ascídia da Cíntia.
Quando os chefes me disseram que eu teria que fazer ME, e ainda por cima de transmissão, quase chorei, pq o-di-a-va essa metodologia (trauma de biogeral), que pra mim nada mais era um monte de borrão (ô despeito...). mas confesso: quando vi minhas imagens, quase chorei, sim, mas de emoção, porque eram L-I-N-D-A-S. Td bem que ñ entendia patavinas (só sabia diferenciar o núcleo do citoplasma), mas isso é questão de olho, de prática.

Muito bem, então a Cíntia me pediu pra procurar artigos que falavam de MET de hemócitos. Pensei “ah, deve ter de montes, especialmente de C. virginica e C. gigas, mesmo gênero que a minha rhizophorae, pois lá na Europa eles estudam bastante essas duas, e Mytilus edulis também, pois lá eles cultivam para consumo, estudam parasitas, efeitos de metais pesados e outras substâncias, expressão gênica etc etc.” qual não foi minha surpresa, ao procurar no web of science e no science direct, apareceram pouquíssimos artigos. Tentei várias palavras-chave, TEM (a tonta tinha tentado MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão, em português, achou nadinha, só o particípio do verbo meet – met rs. O certo é Transmission Electron Microscopy, TEM), haemolymph, haemocytes, crassostrea, bivalves, todas estas palavras combinadas entre si. Nada significativo.

Até que... a Ju, minha grande amiga do lab, que divide comigo o aconchegante cafofo da 32 no underground do fundão... me passa o artigo mágico e salvador:

Sim, Saccostrea glomerata (abaixo), uma ostra que tem só lá na Austrália. Provavelmente não deve ser mais relacionada com a C. rhizophorae que as espécies do mesmo gênero, mas já é um começo (fico devendo para próximos posts uma pesquisa filogenética de ostras, pois acho interessantíssimo levar isso em conta em se tratando de comparar hemócitos, algo que até hj ñ vi em nenhum artigo. Que achas, Mauro e Sil? No início da facul ñ gostava, ou melhor, não entendia muito sobre, mas agora...hehe). E o trabalho é bom, eles fazem muitas coisas que vou explicar melhor no próximo post (estou preparando uma resenha do artigo). Até estava comentando com o Pablito, que o trabalho não é conclusivo, mas abre uma gama de possibilidades e boas idéias. E ele é novíssimo, saiu no início do ano passado.

E é claro, malandramente, até antes mesmo de destrinchar o artigo, corri lá para as referências atrás de outros artigos. Uns muito interessantes. Mas o que falava de caracterização de hemócitos de C. virginica, advinha: ñ tá disponível na web, e a revista tem só lá no Museu Nacional...Já acionei os meus contatos de lá pra ñ ter que me despencar até São Cristóvão. Sempre quando o artigo é aquele que queremos, aquele que vai clarear as idéias, propor uma nova metodologia que dará certo...ele não está disponível :(

Enfim, se não surgir nenhum outro artigo “bombástico”, será este que irei apresentar no meu seminário.