Não existe Pgp?!

Estava relembrando como as células irão (espero eu) se comportar nos experimentos para verificar a atividade de uma proteína que “expulsa” diversas substâncias potencialmente nocivas à célula: a glicoproteína P (cuja abreviação é Pgp). Basicamente, o experimento funciona na seguinte maneira: em uma cultura de células, você adiciona um determinado corante fluorescente (no caso a rodamina B)Se essas células possuírem a Pgp, essa proteína vai “expulsar” o corante do interior da célula e ela pouco fluoresce (para fluorescência, é possível conferir se a célula fluoresce observando-as no microscópio; para quantificar a fluorescência, as células são “lidas” por um aparelho próprio, o citômetro de fluxo). Se é adicionado um inibidor dessa proteína, esta pára de “expulsar” o corante de dentro da célula, que passa a apresentar alta fluorescência (observe o esquema que fiz, abaixo).

Esquema simplificado do funcionamento da Pgp ao adicionarmos o corante Rodamina B

Este ensaio também serve para deduzir se uma determinada substância é ou não expulsa da célula pela Pgp. Se adicionarmos algum poluente, por exemplo o cádmio (sempre puxando sardinha para meu lado rs) e a fluorescência for baixa, significa que o cádmio não é expulso pela Pgp, já que ela estará expulsando o corante. Já se a fluorescência for alta, há duas explicações: 1) o cádmio um substrato para a Pgp (ou seja, a proteína vai expulsar menos corante para também expulsar o cádmio) ou 2)o cádmio é um inibidor da PGP (a proteína expulsa nenhum dos dois compostos)

Bom, e eu preocupada relembrando esses detalhes para analisar os resultados. E ainda nem estabeleci um protocolo de experimentos. Após conseguir manter as células “separadas”, isto é, sem formar agregados usando uma solução anti-agregante, o Rapha me aconselhou a não usar esse tipo de solução quando fizer os ensaios para Pgp, especialmente por conter EDTA, uma substância que torna indisponível cálcio e magnésio para a célula (muito importantes em diversas reações celulares). Eu tinha 2 opções:

1) fazer o ensaio com as células aderidas na placa. Complicação: o uso de tripsina pode danificar seriamente as células.
2) Fazer o ensaio com as células em suspensão. Complicação: como eu não poderia usar o anti-agregante, as células agregariam absurdamente. Além disso, teria que fazer mais centrifugações para retirar e lavar o corante, o que aumentaria mais ainda a agregação.

Procurando na literatura protocolos deste experimento, descubro que a grande maioria (22 de 24 trabalhos listados na base de dados pubmed) utilizam tecidos como brânquia e glândula, e não hemócitos. Apenas 2 trabalhos abordavam hemócitos. Mas em vez de ajudar, fiquei preocupada, especialmente o de Sversson (2003), que não encontrou atividade da Pgp em hemócitos do mexilhão Mytilus edulis, apesar de outro autor (Minier, 1996) ter encontrado uma proteína com mesmo peso molecular de Pgp e reação positiva para um anticorpo anti-Pgp de humano. (Thiago, isto te lembra algo?!)

Fica a pergunta para ser respondida daqui a alguns dias: será que há atividade de pgp nos hemócitos que eu estudo?

Quando a união não faz a força

Trabalhar com células possui seus percalços, que variam de acordo com cada tipo celular. Os hemócitos não fogem à regra. A Paulinha trabalha com hemócitos de caranguejo, e eu com hemócitos de ostra. E compartilhamos um mesmo problema: a agregação (ou coagulação) destas células. Logo que fazemos a punção dos hemócitos, eles se unem em uma maçaroca de células, com a qual não é possível fazer nada. Um grande empecilho. A Paulinha sofre mais que eu: "meus" hemócitos agregam bem menos que os "dela".
Semana passada passei as células no citômetro de fluxo para tentar identificar as populações de hemócitos, necessária para seguir com meus experimentos. Mas a agregação dos hemócitos foi um problema sério. Isso acontece principalmente porque preciso fazer uma centrifugação a fim de concentrar as células e ressuspendi em um meio de cultura, o L-15.
Resultado. Agregou geral.
Em seguida, testei ressuspender as células em uma solução bem conhecida pelo pessoal que trabalha com hemócitos: o antiagregante,que, como o nome diz, impede a agregação. Bingo! células livres, leves e soltas. Resultado. no citômetro, a identificação das células ficou bem melhor.

Sydney rock oyster (Saccostrea glomerata) hemocytes: Morphology and function

Bom, como prometido, um apanhado desse artigo. Gostei dele pq ele fala sobre muitas das minhas dúvidas.
OBJETIVO: S. glomerata é uma das espécies mais importantes cultivadas em aquacultura, e é atacada por uma variedade de doenças infecciosas e infestação de parasitas. E os hemócitos participam de importantes vias de respostas imunes contra estes agentes infecciosos. Além disso, o estresse ambiental nas suscetibilidade e influência nas respostas imunológicas dos hemócitos contra tais os agentes. Sabe-se que temperatura, salinidade e poluentes químicos alteram as atividades dos hemócitos, e estes fatores podem aumentar a suscetibilidade das ostras a infecções. (TRADUÇÃO LIVRE DO ARTIGO)

Na literatura, é muito controversa a classificação dos hemócitos - pra invertebrado td é mais difícil. Mas é concenso que há pelo menos dois tipos padrão: os granulócitos - que possuem grânulos no citoplasma - e hialinócitos - que não os possuem, ou em quantidade muito reduzida. E dentro desss dois tipos é que as classificações podem variar, de acordo com a técnica empregada. neste artigo o autor usou algumas técnicas para criar classificações, baseada na morfologia (em microscopia de luz, de transmissão, de varredura) acido- ou basofilicidade dos grânulos ou citoplasma, tamanho e quantidade de grânulos, etc.

* Para caracterização, ele lançou mão das seguintes técnicas:

1) Separação dos hemócitos por M.O. (contraste de fase interferencial; “time-lapse photophotomicroscopy, que deve ser um aparelho fodástico, que ele tira fotos a cada 5s.)

2) coloração Giemsa/ May-grünwald

3) citometria de fluxo (site óootemo que achei pois ficava quebrando a cabeça de como o citômetro dava o tam. e a quantidade de grânulos nas células)

4) TEM (transmition electron microscopy)
5) SEM (scanning electron microscopy)

* além da caracterização morfológica, o autor também verificou a atividade fagocítica dos hemócitos, empregando os seguintes métodos:

- Imunohistoquímica para detecção de:

1) fosfatase ácida
2) peroxidase
3) fenoloxidase
4) superoxido
5) melanina

* Segundo o artigo, estas substâncias quando presentes no hemócito indicam se ocorre alguma atividade fagocítica. Peroxidade e fenoloxidade, por exemplo, estão presentes nos lisossomos, ou seja, atua como enzimas digestivas.

- Atividade fagocítica:

1) com S. cerevisae corado com vermelho congo

2) encapsulação com hifa de fungo

RESULTADOS

* para microscopia de luz:

Figura 1: Hemócitos em microscopia de luz e C de fase interferencial. Em A, temos a hemoblasto-like. Em B, hialinócito. Em C, granulócito. Em G, um agregado de cél, que graças a Deus ñ tenho visto muito nestas placas que ando fazendo, pois antes tinha muuuito deste tipo. quando tem, são de poucas células. em H, granulócito degranulado.

Abaixo, uma tabela resumida com as características que ele deu para cada cél:

Tabela 1: resumo da microscopia de luz

Graças ao aparelho que tira foto a cada 5s, eles verificaram que quem inicia a formação destes agregados são os hialinócitos, formando agregados pequenos, que aumentam de tamanho, e então "chama junto" os granulócitos, que começam a degranular!!! Logo pensaria: "ah, então os que se acham que é hialinócitos nada mais são que os granulócitos s/ grânulos..." nãaaao! eles viram q são hialinócitos sim. E como degranula? Os granulócitos formam vacúolos e encaminham seus grânulos para dentro destes vacúolos. E em alguns minutos tudo desaparece misteriosamente....rs


A Barracco já havia me falado que o granulócito de C. rhizophorae degranula. Eu também suspeito que uns pontinhos bem pequenininhos que vejo nas minhas placas sejam grânulos dos granulócitos. Mas uma foto tão bacana quanto a H...

Outra coisa que me surpreendeu: granulócito com auto-fluorescência em UV (figuras E e F)! Vai, por essa vc ñ esperava, ñ é?

Figura 2: Granulócitos sob luz UV

* Para citometria de fluxo:

Sobre citometria de fluxo, ele utilizou 5 individuos. Encontrou uma variabildade alta, mas pôde-se distinguiur basicamente 4 populações.
Em algumas ostras foram encontrados apenas R1 e R2, enquanto que em outras, foram encontrados todas as subpopulações. Ao observarem no microscópio, confirmou-se que R1 são granulócitos e R2, hialinócitos. Já R3 e R4 não puderam ser eficientemente classificados devido ao baixo número de células por região.

Abaixo, um resumo:

Tabela 2: Diferentes subpopulações de hemócitos classificados por citometria de fluxo

* Para Imunocitoquímica:

baixo, uma tabelinha resumida. As fotos estão bem bacanas, mas não vou adicioná-las aqui pois vai ficar imenso o post.

Tabela 3: Imunohistoquímica

Ou seja, todas as imunos deram positivas para todas as substâncias em granulócitos. Como eles fagocitam mais ativamente, há maior produção destas enzimas (fosfatase ácida, peroxidase, fenoloxidade) além de superóxido e melanina, todos envolvidos em processos de degração de corpos estranhos fagocitados por eles. Provavelmente por fagocitar menos, hialinócito deve não produzir, ou melhor, produzir quantidades muito pequenas destas enzimas.

FAGOCITANDO...

O autor viu que tanto granulócitos quanto hialinócitos tem habilidade de fagocitar, neste experimento ele utilizou o fungo C. cerevisae (péssimas lembranças...rs), sendo os granulócitos mais eficientes - teve um lá que fagocitou até 30 céls! Uma diferença interessante: os granulócitos não emitem filopódios para fagocitar ( ou então filopódios muito curtos): eles "engolfam" (verbo do artigo - engulfed) por invaginação da membrana. Já os hialinócitos emitem looongos filopódios.

Os granulócitos também encapsulam hifas (este processo ocorre qd a partícula estranha é mt maior que a célula). Alguns granulócitos ficaram em torno da hifa, e antes mesmo de ter algum contato, alguns degranularam. e no final de 40min, todos q estaavam participando do processo degranularam. No entanto, os hialinócitos pouco participaram deste processo. E também fizeram uma coloração para verificar a melanização destas cápsulas. Após uma pesquisa rápida no Oráculo - em fontes confiáveis, claro), a melanização ocorre após a ativação da cascata de fenoloxidase (PO), e este processo é uma resposta do sistema imune que também ocorre em vários outros invertebrados.

* Para TEM

Agora vamos p/ parte que interessa. Na TEM, ele divide os hemócitos em váaarios subtipos (4 sub- p/ hialinócitos e 5 sub- p/ granulócitos) baseados na razão citoplasma:núcleo (C:N), formato do núcleo, se forma ou não filopódio, se tem retículo (aliás aquelas "minhoquinhas" q a cíntia tinha falado q era reciclagem de membrana tá com cara de ser retículo...) , etc. e os grânulos? OITO tipos diferentes... e o autor hipotetiza queestes diferentes tipos de hemócitos podem ser diferentes estágios de uma via de maturação destas células, ou que simplesmente são mudanças súbitas individuais - sem via nenhuma. Já os OITO tipos de grânulos, ele diz que não está claro do porquê desta diversidade, mas que é frequentemente encontrado em outros bivalves. E pode ser que cada tipo de grânulo seja especializado em uma específica via de defesa na célula.

Mas eu acho que o técnico lá da uerj tava com razão...ficou pouco contrastado, em comparação com as microfotos do artigo

That´s all, folks!