Poli-lisina e aderência celular

AS células sempre procuram um substrato para aderir, não costumando ficar em suspensão em uma solução. Este substrato pode ser placas de petri, lâminas, lamínulas... Aliás, a desaderência pode ser até indício de que a célula está entrando em morte celular programada, também conhecida como apoptose.

E alguns tipos celulares são danados para não aderir. Ou melhor, elas ficam aderidas por um (pouco) tempo, de algumas horas, mas se é preciso fazer experimentos com exposição de drogas por períodos muito longos, algo como 24h, 48h, 72h com o passar do tempo o número de células aderidas pode diminuir substancialmente.

Para melhorar esta adesão, existem substâncias que são muito empregadas nos laboratórios, como colágeno e laminina, que são proteínas de matriz extracelular (é o material que fica em volta das células, que mantêm a aderência entre as células, formando tecidos, além de outras funções). Elas em geral atuam por atrações de carga: como o lado externo da célula possui carga líquida positiva, estes compostos possuem carga negativa. Inclusive li um trabalho que comparava qual seria a melhor substância para melhorar a adeão celular. E a campeã foi a poli-D-lisina.

A polilisina é um polímero (por isso o prefixo poli) feito do aminóacido lisina. Em outras palavras, é uma lisina "amarrada" na outra. Se a o grupo carboxila do aminoácido lisina "estiver" (na verdade este conceito é muito complexo para explicar am poucas linhas) na esquerda, teremos a poli-L-lisina. E se "estiver" na direita, teremos poli-D-lisina. Sendo que, na natureza, só encontramos proteínas formadas com aminoácidos na forma L.

Sempre usei poli-L-lisina para melhorar a aderência das minhas células, o que de fato ocorre. Porém lendo um artigo que a Ju me enviou, os autores usaram a versão D, sendo que em todos os artigos já lidos por mim a forma usada era a L. Mais tarde, pesquisando no site da Sigma-Aldrich, uma empresa que vende produtos para laoratório, estava escrito na seção FAQ a diferença: como a forma L é encontrada na natureza, alguns tipos celulares podem digeri-la, através de proteases. Nestes casos, a forma D seria a mais recomendada.

Então veio a pergunta: será que meus hemócitos estariam digerindo a poli-L-lisina? Será que eles secretam proteases? Sim, é possível, já que são células circulantes na hemolinfa, e responsáveis pelas respostas de defesa contra patógenos. Mas para não ficar no "achismo", busquei artigos que tivessem feito algum tipo de reação para proteases. Achei um trabalho que fazia detecção de diversas enzimas, entre elas...proteases.

Outro detalhe: buscando mais informações sobre polilisinas, vejo uma pergunta sobre a poli-L-lisina que uso:

- "A polilisina P8920 (nº do catálogo) pode ser usada para cultura de células?"

- "NÃO (grifo meu), pois ela contém 0,01% de timerosal, que é um conservante. Este produto é indicado para aderência de tecidos em lâminas. Para culturas de células, deve ser usado o produto PXXXX que é similar mas sem o conservante".

Ainda, mas ainda bem que não consegui encomendar a poli-L-lisina...

Quando o equívoco se torna um acerto

Continuando do post abaixo, fiz o L-15 em pó. Na verdade, ele só estava na minha geladeira porque nosso representante Marco Aurélio se equivocou e me trouxe L-15 em pó, em vez de líquido. Quis trocar, mas o Mauro achou melhor ficarmos com o pó para mais tarde testarmos – além de ser uma grande economia: na embalagem vinham 10 vidros e cada um fazia 1L de meio! Confesso que fiquei descrente, como sempre. Vivia dizendo para mim mesma fazer o pó para assegurar que funcionava. Fui enrolando, enrolando... contudo percebi que chegara a hora. Calculei o peso do L-15 em pó para fazer 200mL de meio, pesei o HEPES para 25 mM (alguns artigos diziam 20, outros 25 mM...). Dissolvendo, ficou rosa, como imaginei, mas o pH estava mais baixo, 8,5 se não me engano. Fui adicionando HCl e voilà! Consegui chegar a 7,2!
Filtrei com o filtro pequeno, usando a seringa grande (deu trabalho!) e o líquido ficou praticamente da mesma cor que o comprado pronto.

L-15 em pó (esq) e o de garrafa (dir)

Agora faltava testar... Mas antes, gostaria de fazer um parênteses sobre a polilisina. Neste meio tempo de tentar acertar o HEPES, peguei na Silvana um pouco de solução de polilisina para testar, pois esse polímero ajuda na aderência das células. Testei em umas plaquinhas que não são muito boas e realmente a aderências das células foi maior com a poli-, tanto no controle como no Cádmio. Bom, muito bom... fecha parênteses.

Fiz plaquinhas para testar o meio novo. Senti bom sinal ao ver que o L-15 não ficou amarelado quando eu adicionei o Cd, o que significa que o pH se manteve estável. Após 24h, ao olhar no microscópio as células estavam ótimas, tanto controle quanto cádmio, muitas células aderidas. Chegou a hora da verdade: o vermelho neutro...tcham tcham...

CONTROLE: células ótimas, aderidas e muito pouco coradas. Há muito tempo que não via as células assim, citoplasma limpo, ou com alguns pequeninos lisossomos.
CÁDMIO: células aderidas e...coradas! Sim, finalmente as células não estavam mais com aqueles aspecto amarelado, redondas, elas estavam coradas, até havia algumas que não estavam. E havia mais células soltas do que o controle, como eu imaginei, umas coradas, outras não.

Vi uma célula especial, acho que do cádmio, com grânulos (eterna dúvida, grânulos ou lisossomos?) e um vacúolo enorme. Me distraí e quase perdi a hora do Praça XV! Deixei algumas coisas sobre a bancada (desculpa ju, eu arrumei no dia seguinte)desliguei tudo, tranquei a porta e saí correndo!