As nuances do percoll

Apesar de não usar mais o percoll para separar minhas células, queria deixar um registro da minha experiência com esse reagente.

O percoll é um colóide feito com micropartículas de sílica, recobertas com um polímero, (PVP – polivinilpirrolidona) cuja função é deixar o colóide atóxico para as células. Existem protocolos bem estabelecidos especialmente para separar linfócitos, monócitos ou outras células do sangue.

Muito bem, você decidiu trabalhar com percoll, pois viu um artigo da sua área que utilizava este método de saparação. Com o reagente em mãos, basta diluir para as concentrações do artigo e... nada disso. Primeiro, vá no site do fabricante e faça o download do datasheet (arquivo que contém informações sobre o produto). Você verá que o pH do percoll da garrafinha é 8,9 e a osmolaridade de aproximadamente 32 mOsm! Ou seja, é para matar qualquer célula.

Eu diluía o percoll em uma solução antiagregante (que impede que os hemócitos da ostra agreguem) e pensava que automaticamente o pH e a osmolaridade se ajustassem. Engano meu: continuava básico. Bastava então corrigir o pH com HCl, certo? Só que o HCl faz o percoll virar uma gelatina branca, pois altera a densidade. Mesmo usando um HCl muito diluído, precisaria de um volume grande, o que também alteraria a densidade. Para resolver esse pepino, é preciso diluir o percoll em alguma solução tamponada, ou seja, que possua algum reagente capaz de regular o pH (como o hepes, que é o que uso, ou algum PBS) inicialmente. Como o antiagregante não tem ação tamponante, o pH continuava alto.

Já a osmolaridade é mais complicada, principalmente se você não tem um osmômetro por perto. A saída é fazer diálise (li esse processo em artigos que separavam hemócitos de ascídias), colocando o percoll em uma sacola de plástico semipermeável e deixar agitando overnight na sua solução, com a omolaridade desejada. Porém, há um jeito mais fácil. Basta diluir nove partes de percoll mais uma parte de NaCl a 1,5M. A osmolaridade final fica em torno de 320 mOsm, que é a osmolaridade do meio de cultura que uso (Leibovitz L-15). Queria ter a oportunidade de medir esta diluição final em um osmômetro, só para garantir, mas não conheço ninguém que possua este aparelho lá na faculdade.

Pronto, pH e osmolaridade acertadas, agora é só fazer as diluições necessárias para um gradiente de percoll, contínuo ou descontínuo. E não se esqueça como o percoll de trabalho é 90%, caso você use concentrações em porcentagem.

Segredinho: tive todas essas dicas ao enviar um email para o suporte técnico da Sigma-Aldrich (email em inglês, sure). Eles são fantásticos, sabem muito e são super prestativos. Eu sei que diariamente exercitamos nossa capacidade de raciocínio para solucionar problemas, mas quando trabalhamos com um reagente, kit ou aparelhos novos, além da importância de ler o MANUAL, vale a pena ter contato com o pessoal do suporte técnico, pois no caso dos reagentes, nem todo datasheet é completo. Assim, economizamos tempo precioso e nos dedicamos ao que realmente interessa: nossos experimentos!

Quando o equívoco se torna um acerto

Continuando do post abaixo, fiz o L-15 em pó. Na verdade, ele só estava na minha geladeira porque nosso representante Marco Aurélio se equivocou e me trouxe L-15 em pó, em vez de líquido. Quis trocar, mas o Mauro achou melhor ficarmos com o pó para mais tarde testarmos – além de ser uma grande economia: na embalagem vinham 10 vidros e cada um fazia 1L de meio! Confesso que fiquei descrente, como sempre. Vivia dizendo para mim mesma fazer o pó para assegurar que funcionava. Fui enrolando, enrolando... contudo percebi que chegara a hora. Calculei o peso do L-15 em pó para fazer 200mL de meio, pesei o HEPES para 25 mM (alguns artigos diziam 20, outros 25 mM...). Dissolvendo, ficou rosa, como imaginei, mas o pH estava mais baixo, 8,5 se não me engano. Fui adicionando HCl e voilà! Consegui chegar a 7,2!
Filtrei com o filtro pequeno, usando a seringa grande (deu trabalho!) e o líquido ficou praticamente da mesma cor que o comprado pronto.

L-15 em pó (esq) e o de garrafa (dir)

Agora faltava testar... Mas antes, gostaria de fazer um parênteses sobre a polilisina. Neste meio tempo de tentar acertar o HEPES, peguei na Silvana um pouco de solução de polilisina para testar, pois esse polímero ajuda na aderência das células. Testei em umas plaquinhas que não são muito boas e realmente a aderências das células foi maior com a poli-, tanto no controle como no Cádmio. Bom, muito bom... fecha parênteses.

Fiz plaquinhas para testar o meio novo. Senti bom sinal ao ver que o L-15 não ficou amarelado quando eu adicionei o Cd, o que significa que o pH se manteve estável. Após 24h, ao olhar no microscópio as células estavam ótimas, tanto controle quanto cádmio, muitas células aderidas. Chegou a hora da verdade: o vermelho neutro...tcham tcham...

CONTROLE: células ótimas, aderidas e muito pouco coradas. Há muito tempo que não via as células assim, citoplasma limpo, ou com alguns pequeninos lisossomos.
CÁDMIO: células aderidas e...coradas! Sim, finalmente as células não estavam mais com aqueles aspecto amarelado, redondas, elas estavam coradas, até havia algumas que não estavam. E havia mais células soltas do que o controle, como eu imaginei, umas coradas, outras não.

Vi uma célula especial, acho que do cádmio, com grânulos (eterna dúvida, grânulos ou lisossomos?) e um vacúolo enorme. Me distraí e quase perdi a hora do Praça XV! Deixei algumas coisas sobre a bancada (desculpa ju, eu arrumei no dia seguinte)desliguei tudo, tranquei a porta e saí correndo!

O problema do HEPES

No final deste post escrevi que o Mauro sugerira de um fazer HEPES que ficasse a uma concentração de 20 mM no L-15. Então, tive a idéia de fazer uma solução bem concentrada de HEPES para adicionar o menor volume possível ao L-15. Fiz os cálculos para 2 M, o que me faria adicionar algo em torno de 10 uL/mL ao meio.
Mas como sempre, tive problemas, e como sempre, tentei resolvê-los. Uma verdadeira Saga de Hades (rs)

1ª tentativa: a massa de HEPES a ser pesada era de 26g...para ser diluído em apenas 50 mL! Adicionei 40 mL em um béquer e vamos à diluição. No fim, o volume havia mudado para 60 mL! A Ju sugeriu de eu pesar mais um pouco para completar 75 mL de solução a 2 M. Deu certo. Agora, ajustar o pH: de 11 para 7,5. Pinga HCl. Pinga, pinga...nem sei o quanto de volume coloquei mas foi grande e nem chegou a 8,5! Desisti.

2ª tentativa: Diminuí a concentração para 1 M (o que reduz a massa para 13g, mantendo o volume de 50 mL) – agora não lembro se foi por causa do problema do volume ou do pH. Consegui diluir e avolumar para 50 mL. Hora de ajustar o pH. Desta vez eu medi no lab da Silvana, pois o nosso estava sem eletrodo.Continuou 11. Pinga HCl. Pinga...pinga...pinga...e o pH precisava estar em torno de 7,5, só que eu já tinha adicionado 4 mL de HCl e nem a 8 chegou. Mais uma vez, descarte, pois 4mL é um volume considerável e com certeza alterou a concentração da solução. Desisti.

3ª tentativa: Fiz novamenta a solução a 1M, mas desta vez usei o Ac nítrico CONCENTRADO (mais ou menos 80%) , direto da garrafa, para ajustar o pH, após longa conversa com o Mauro sobre grau de dissociação de um ácido. Vai para a capela com pHmetro de bancada, agitador magnético, luvas. E aconteceu como nas outras vezes: pinguei 80 gotas com a pipeta Pasteur (nas outras vezes usei micropipeta 1000uL). Achei muito e calculei o volume: 1 mL = 20 gotas, 80 gotas equivale a...4 mL... Desisti mais uma vez.

O que acontece é que o HEPES é um tampão, ou seja, ele não permite grandes variações de pH e sua faixa de tamponamento é de 7,5 a 8,5 mais ou menos. Ou seja, se a solução estiver nesta faixa, você pode pingar ácido ou base (quase) à vontade que o pH se mantém estável.
Procurei por protocolos no site protocol-online.org e fiquei surpresa ao ver que eles ajustavam o pH com NaOH! Como é possível, se a solução já estava básica? Pensei que fosse assim devido a alguma reação química do tipo íon comum, ou algo que desconhecia. Mas reparei que o HEPES usado por ele tinha peso molecular diferente do meu. Procurando nos catálogos de reagentes (eles não servem apenas para apoiar monitores de PC rs) vi que existiam dois tipos: Sodium Salt (o que eu tinha) e o Free Acid (que ao contrário do que pensei, não é livre de ácido, mas sim que libera ácido livre). E a diferença entre os dois era a presença de Na e ausência de H no Sodium Salt. Pronto, estava explicado, era esse o motivo.
Perguntei para a Tatiana (irmã da Ju) se ela tinha o HEPES free acid (que libera ácido) mas o que ela tinha era igual ao meu. No lab dela eles trabalham muito com culturas e conversando ela me disse que o HEPES é pesado junto com o meio em pó. Porém, meu meio era líquido e estéril. Por isso que eu queria uma solução concentrada...

Aceitei a sugestão dela e decidi fazer (após falar com Mauro, claro) o L-15 em pó que há meses está na geladeira.

... Ficou rosa!!!

Nem ia escrever hj, mas depois do cochilo maravilhoso que tirei no ônibus (o piloto apagou todas as luzes! aquele buzu maravilhoso, poltrona acolchoada...) me animei.

Hoje fiz uma placa (16 poços, somente) só para ver tripan. A concentração de Cd que usei foi a mesma, de 1 uM. Sobrou um restinho de L15, então resolvi pôr em prática uma idéiazinha hehehe (Mauro, não briga rs)

Já que o L-15 tem phenol red, que é um indicador d pH, e a coloração fica amarela em pH ácido (por volta de 6), será que seu adicionar NaOH vai voltar a ficar vermelho?

Então, pequei o restinho de meio que sobrou, adicionei o cloreto de cádmio para que ficasse a

1 uM (como sempre faço). Cor: amarelo. Peguei a solução de NaOH a 1 M e adicionei 20 uL. INSTANTANEAMENTE ficou.... da cor da flor aí do lado. Claro que não era a cor que eu queria, mas mostra que se o pH mudar de novo, o indicador também muda. O que siginifica que posso usar para ajustar o pH com o NaOH, sem necessitar de fitinha ou ter que mergulhar o eletrodo do pHmetro no meio com Cd. Só diluir um pouco o NaOH (1 M é muito contrado) e ver o menor volume possível para adicionar ao meio, sem alterar muito o volume inicial.

O mistério perto do fim...

Quem disse que papear no msn é perda de tempo?!?!?!
Ontem eu e Ju, nos gostamos tanto, mas tanto, que além de convivermos praticamente todo dia no cafofo, ainda temos papo pra ficar no msn. Os assuntos podem ser vários, mas ontem foi principalmente sobre o meu exp d sexta, do azul de tripan.
Ah, antes de tudo, ela me passou por email um artigo bombástico: “Crystallization of neutral red vital stain from minimum essential medium due to pH instability”. Mas claro, todo artigo bombástico nunca está disponível na web. Se eu tiver sorte, encontro na biblioteca do CCS (tem o periódico, mas o artigo...sorte!!!) De fato, logo quando começamos os experimentos com Cd, percebia-se nitidamente que o L-15 mudava de cor, de rosa/vermelho para amarelo ao add o Cd. Medi o pH, mas tava entre 6 e 7 (usando a fitinha de cores). Td bem. Agora nos ocorreu de comparar o pH do meio sem e com Cd. Diferença de 1 ponto, para baixo, ou seja, o Cd acidificava o meio.

Meio de cultura Leibovitz L-15

E papeando pelo msn com a Ju, ela continuou investindo q o problema era o pH, e realmente é o que parece ser. Até q ela perguntou se o L15 tinha alguma substância indicadora de pH. Lembrei de um nome, e fui no site da invitrogen para lembrar: phenol red. Bastou uma procurada no Oráculo para descobrirmos que essa substância é... um indicador de pH!!! E advinha que cor fica quando o pH se torna ácido???
Juntando essa informação com a do artigo... (me senti agora um Watson&Crick juntando os dados da Rosalind Franklin e fazendo a descoberta do século!). Uma boa justificativa que responde às indagações do post anterior, de porque que as céls (vivas, como assegurou o tripan) com ñ coram com VN, mas o ctrl, sim. Porém, outra pergunta: então por que quando eu colocava a placa na geladeira (mais ou menos 6ºC) as céls com Cd coravam (exceto 2uM)? Segundo a Ju, devido à diminuição da fluidez da membrana. Mas isso pra mim ainda não está claro.
Outro questionamento: o L-15 não deveria ter um tampão?! Ó o que ta escrito no site da invitrogen, sobre o L-15: “L15 formulations were developed without a sodium bicarbonate buffer system. L15 medium is buffered by phosphates and free-base amino acids (L-arginine primarily, but also L-histidine and L-cysteine)”. Será que o Cd acaba ultrapassando a “faixa de tamponamento”?
Enfim, agora é arrumar um jeito de corrigir o pH do L15 com Cd (será que de amarelo vai ficar vermelho/rosa novamente)?.
E Ju, só pra deixar público, muitíiiiiiiiiiiiiiiiissimo obrigada pela força. Toda semana essa menina me dá um artigo novo, e artigo dos bons! Fico até com vergonha de não procurar direito hehehhe