Para transcrever precisa duplicar?

Provavelmente esta pergunta já havia sido respondida por mim, mas há alguns tópicos que vão embora, não se fixam na minha cabeça.

Agora que terminei de ler e resumir no caderno o Biologia Molecular da Célula para fazer a prova do mestrado, estou retomando os capítulos iniciais que sintetizei no meu caderno. E logo na primeira página, está escrito, no cantinho de cima: “tem que duplicar antes de transcrever?”
Eu me refiro ao clássico trio “duplicação-transcrição-tradução” que muitos de nós aprendemos (ou não) no Ensino Médio. E é surpreendente como algumas dúvidas simples (ou nem tão simples assim) permanecem mesmo após praticamente concluir o Ensino Superior – já que iniciei meus estudos para o mestrado em agosto de 2008.
Bom, vamos retomar rapidamente o que significa cada um dos termos do “trio”:

1) Duplicação – também chamado de replicação: Este é o nome do processo em que o DNA é...duplicado! Parece simples, mas não é. A quantidade de proteínas e enzimas necessárias para fazer este processo não é brincadeira. Tem uma enzima que desenrola a fita dupla de DNA, outra vai adicionando os componentes para formar a nova molécula, e tem também uma que fica mais a frente da fita para impedir que a molécula de DNA não embole de vez a ponto de enzima alguma dar jeito.

2) Transcrição: este processo cria uma molécula de RNA usando uma molécula de DNA como molde. Também são necessárias várias enzimas para que aconteça este processo

3) Tradução: a partir da molécula de RNA criada a partir do molde, há a formação de proteínas, e contam com a participação de várias moléculas diferentes dos processos anteriores.

Estes três processos são bastante longos, complicados e fascinantes de explicar em poucas linhas: cada um merece pelo menos um post específico. Mas o mais importante é: qual o objetivo final de cada processo?

Bom, a duplicação ocorre quando a célula vai entrar em divisão, ou seja, uma célula dará origem a outra.. Como se em algum filme de ficção cientifica um clone saísse de você. E para isso, a célula não pode dividir o seu precioso material genético ao meio: ela primeiro duplica, e depois divide. Já o objetivo da transcrição E tradução é basicamente formar proteínas. Logo, a célula não precisa estar em momento de divisão para que ocorra a transcrição e tradução: são processos que ocorrem continuamente. Porém, se a célula vai se dividir, além de duplicar seu DNA ela precisa crescer em tamanho: aí sim, a transcrição e tradução de proteínas acontecem a todo vapor.

Por isso que não entendo quando na escola (e inclusive na faculdade) aprendemos os três processos em sequência. É confuso, mas é lindo :)

Quem Descobriu? - O DNA como transmissor da hereditariedade

Nós aprendemos na escola que o responsável pela transmissão da informação genética é a molécula de DNA. Aliás, no CAp (Colégio da Aplicação da UFRJ), a minha “aula inaugural”, chamada de regência, foi sobre mitose e englobou também alguns conceitos envolvendo o DNA: cromossomos, cromátides, compactação do DNA, etc. A aula foi sobre como a célula se divide em duas, e como a sua célula-filha continua tendo o mesmo material genético e em igual quantidade que a célula-mãe. Mas isto será tema de outro post.

Voltando à transmissão da informação genética: é provável que algum aluno mais curioso tenha se perguntado: “mas como eles descobriram que era o DNA?”. Muito simples: fazendo experimentos.

Quem deu o pontapé inicial foi Frederick Griffith, nos anos de 1928 (Detalhe: O DNA já havia sido descoberto nessa época, só a sua estrutura molecular que foi elucidada por Watson e Crick. Pelo amooor de Deus, não foram eles que descobriram o DNA!!!). Ele trabalhava com dois tipos de uma bactéria pneumococus: uma encapsulada que causava infecção em ratos (portanto, era patogênica) e outra não encapsulada, que não causava infecção em ratos. (PS.: Algumas bactérias possuem uma cápsula em torno da sua parede celular). Ele identificava as colônias das bactérias a partir do aspecto das colônias: às não patogênicas chamou de R (do inglês rough, que significa rugoso) e às patogênicas, de S (do inglês smooth, que significa liso). Para facilitar a leitura do texto, vou criar uma legenda: Bactérias R são ñPat. (não patogênicas) e bactérias S são Pat. (patogênicas).

Esse é o F. Griffith

A partir disso, ele fez alguns experimentos. Injetou as bactérias S (Pat.) vivas em camundongos. Como era esperado, os ratos morreram. Em seguida fez o mesmo utilizando as bactérias R (ñPat.) e os ratos sobreviveram. Um terceiro experimento foi injetar as bactérias R (ñPat.) mortas pelo calor. Será que os ratos sobreviveram? Sim, sobreviveram, afinal as bactérias patogênicas foram mortas pelo calor. Então Griffith pegou os “restos” das baterias S (Pat.) mortas pelo calor e misturou com bactérias R (ñPat.) vivas e injetou esta mistura nos ratos. Aposto um doce como os ratos sobreviveram, alguém diria... mas não, os ratos NÃO sobreviveram. Para ter certeza dos resultados, Griffith repetiu várias vezes este mesmo experimento para ter certeza que tudo estava certo. Então ele verificou amostras de sangue dos ratos mortos no último experimento e encontrou as bactérias S (PATOGÊNICAS) vivas. Como foi possível, se antes ele havia injetado as bactérias S mortas pelo calor e os ratos sobreviveram? Havia alguma substância que transformou as bactérias do tipo R no tipo S.

E os responsáveis por desvendar este mistério foram 3 pesquisadores: Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn MacCarty. O ano: 1944. Eles usaram as mesmas bactérias, só que em vez de injetar em ratos, eles faziam culturas delas em placas de Petri, além de trabalhar com extratos celulares destas bactérias (o extrato celular é o líquido que se obtém após romper as células, contendo todas as substâncias presentes). Eles meio que “repetiram” os experimentos de Griffith. Primeiramente, fizeram uma cultura das bactérias R (ñPat.). Em seguida, rompeu as bactérias S (Pat.), ou seja, fez um extrato celular, e adicionou em uma cultura para células. Como era de se esperar, não cresceu nada. Agora eles pegaram as bactérias R (ñPat.), misturaram com extrato celular das bactérias S (Pat.) e preparou a cultura. E as células que cresceram foram...as do tipo S (PATOGÊNICAS)! Viu como foi repeteco do experimento do Griffith? Agora vem a novidade: eles queriam descobrir qual molécula era responsável pela transformação da bactéria R em S. Então eles prepararam o seguinte experimento: misturaram às bactérias R (ñPat.) vivas o extrato da S adicionado de: 1)enzima protease (que degrada proteínas); 2) DNAse (que degrada o DNA) e 3) RNAse (que degrada o RNA). A idéia era a seguinte: se a proteína fosse responsável pela transformação da bactéria, se adicionarmos algo que destrua/acabe/inative com a proteína a bactéria não vai se transformar. Este raciocínio serve também para o DNA e RNA. E então, qual cultura não cresceu bactéria, a de nº 1, nº2 ou nº 3? Respostas no “meus comentários” deste blog, por favor... e com justificativa!

Este é o Oswald Avery

Fim de ano, arrumando a casa

É comum a gente tirar o fim de ano para arrumações: arrumar o(s) armário(s), o quarto, se livrar do material acumulado ao longo do semestre/ano para dar espaço a mais material, se livrar de dívidas, enfim, arrumar a casa. E aqui no laboratório não é diferente. Vai chegando fim de período (provas, trabalhos, provas, relatórios, estuda, estuda, e mais provas), que já é uma correria, quando é fim de ano então, nem se fala. Somando a isto fim de graduação (monografias, relatórios, documentos, colação de grau, nada consta, formatura, etc, ou seja, meu caso) parece que 24 horas é nada. Graças a Deus que a prova do mestrado foi adiada para fevereiro, se não estaria realmente enlouquecendo.

Como ia falando, fim de ano não deixa de ser fim de ano no laboratório. Os experimentos vão ficando escassos. E também é época de avaliar a produtividade do ano, analisar resultados, pensar em novos projetos, sair em busca de novos financiamentos...e arrumar o laboratório. Fazer uma lista de tudo que falta e o que precisa ser organizado, para começar o ano tinindo de novo, sim senhor!

Já que a Ju ia (ou melhor, foi) para a Itália domingo último, combinamos de fazer as duas coisas que o laboratório precisava com urgência: descongelar a geladeira e o freezer, que estavam afogados em gelo. Secadores de cabelo e faquinhas e colheres a postos, partimos para a empreitada, com muita música, é claro, na última semana. Aproveitamos também para jogar muitas coisas fora, reorganizar outras para os armários, organizar a bancada do gel...

"Seu Freezer" descongelado, pronto para o verão

Juliana com a mão na massa!

Agora que estou só (a Giselle como está passando por todo o processo de fim de ano descrito no 1o parágrafo, pouco aparece), estou me dedicando a pequenas miudezas do lab. Comprei um pendurador de roupas, para pendurar nossos jalecos, que ficavam jogados sobre o "frigobar"; comprei uma caixa grande (daquelas de plástico para guardar brinquedos, por exemplo) para fazer um banho e deixar a vidraria de molho em Extran (um tipo de tetergente mais forte que o Limpol) e uma menorzinha para fazer o banho do ácido nítrico e deixar a vidraria contaminada com metais pesados de molho.

O próximo passo é comprar um filtro externo para aquários, e transferí-lo do lab onde ele está para cá, na 32. Lá no outro a temperatura varia muuuito, há dias que vou pegar ostras para experimentos e a água está morna. E ter estes fatores físico-químicos (pH, temperatura, salinidade...) variando muito não é legal para experimentos.

Promessa de fim de ano: procurar uma assistência técnica para limpeza do ar condicionado. Não faço i-déi-a de como limpa um Springer (aquele ar-condicionado que é compridinho). Os que temos é fácil, spo tirar a telinha e lavar. Mas esse...todo cuidado é pouco, pois sem ele é impossível ficar no lab (subsolo +tamanho diminuto + verão do RJ, imaginou?).

Com certeza há outras miudezas para ajustar, mas aos pouquinhos chegamos lá.

Mais um erro que vira acerto

Quinta feira a Ingrid ia contar uma placa - desta vez usando o L15 com HEPES e no dia seguinte, Só que quando cheguei no lab, voltando do CAp, vi que ela tinha esquecido de retirar o VN e adicionar o L-15 para só depois contar. Tudo bem, falhas acontecem, e ainda perguntei se ela conseguiu contar com o VN lá. E sim, é possível contar com o VN no poço! Eu tirava porque no início dos meus experimentos com este corante percebia que as céls estavam ficando ruins por causa do corante, mas agora relembrando com meus botões percebo que as céls já não estavam muito boas. Agora está resolvido uma das diferenças do meu protocolo de VN para o do Moore e cia.

Como montar um experimento???

Dúvidas ó dúvidas...

Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.

Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.

Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!

Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?

Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.

E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...

Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)

Quantas dúvidas, quantas idéias...

Aventuras em Angra dos Reis

Na sexta última (1), fomos eu e Ju para Angra enfrentar os coquilles (Nodipecten nososus, família Pectinidade). Eu, especialista em puncionar hemolinfa do músculo, fui junto para fazer o trabalho e ajudar a Ju no mestrado dela. E ela retirou as brânquias, glândula digestiva e músculo (e que músculo!)

Depois de 2h e meia na kombi barulhenta e sacolejante, após diversas retenções por conta das obras de duplicação de pista e reforma dos 2 túneis que vão para a costa verde, chegamos ao projeto POMAR, onde a Petrobrás instalou um centro de cultivo de sementes (bivalves jovens). O dia estava lindo e tínhamos a vista para o mar. Esperamos o Petrus achar o contado dele e, de cara com os coquiles, começamos nosso trabalho. Gastei uns dois coquiles para achar a posição correta de furar (não era tão difícil assim como pensei). O músculo do bicho é enorme, e bem forte, pensei que ia tirar litros de hemolinfa. Que engano... o máximo que consegui tirar foi 1 mL, e muitas vezes cheio de pedaços de tecido, que analisando depois eram ora pedaços do manto (parte mole do bicho que fica preso mais externamente à concha, na beiradinha) ora da brânquia, que rodeava um pouco o músculo e era de cor alaranjada. Mas a melhor (ou pior) parte foi "judiar" do bichinho. Eu distraída e o Petrus chamou a atenção de que o coquiles, mesmo depois de ter as valvas (cada metade da concha é chamada de valva) separadas, ele continuava contraindo o músculo como se fosse para fechar as valvas. Ao estimular o manto ou o próprio músculo, este se contraía e o manto também mexia! A Ju ficou morrendo de pena, repetiu diversas vezes que ela não ia para o céu, disse"tadinho!" umas cem vezes e eu, sádica, cutucando o bicho. Até que um parente dele se vingou com um golpe de mestre: gentilmente "se abriu" para eu espetar o músculo com a seringa e enquanto fazia força para puxar o êmbolo Plof! Ele dá uma contração com toda a força! Quase que meu dedo vai, quase que me espeto com a agulha. Xinguei o bicho, e como xinguei. Tive que apertar as duas valvas para que não ocorresse de novo.

Imagem do coquiles aberto. A parte branca na imagem é o músculo que fecha as valvas; a parte laranja são as brânquias.

Eu e a Ju abrimos mão do nosso almoço (o Petrus e o Carlos, que nos levou até lá almoçaram enquanto trabalhávamos) para voltarmos logo na sacolejante e barulhenta kombi, percorrendo as sinuosas pistas daquela região. Não me aguentei: dormi em cima da minha mochila e só acordei já na Av. Brasil. Pensava que a hemolinfa não tinha sido suficiente, que a Ju não conseguiria extrair quase nada de RNA... e qual não foi nossa surpresa, ao chegarmos no lab, que havia uma "maçaroca" branca decantada no falcon! Isto muito provável é sinal de hemócitos, e a Ju havia me falado antes que aconteceu o mesmo com os hemócitos das ascídias da Cíntia, de tanta célula que havia.

Como já estávamos enjoadas de carro, era sexta feira e nem brincando queríamos pegar a Av. Brasil, fomos embora de barca. Melhor balançar de outro jeito...

Ah, mais algumas informações sobre o projeto e o coquilles, clique aqui.

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 5

Finalmente o último dia.

A aula de manhã foi com o Rubem, o coordenador do nosso grupo de seminário. Figuraça. Ele falou de morte celular: apoptose, autofagia e autólise. Muito bom e muito importante pois é um tema que pode cair na prova do mestrado (rs). Ele terminou a aula mais cedo para que pudéssemos nos preparar para o seminário, pois os outros membros do meu grupo tiveram problemas para preparar as partes deles. A Tati, coitada, depois de ter virado a noite preparando a apresentação, ao mesmo tempo que em fazia outras dezenas de coisas, quase surtou quando às 5 da manhã, já com a apresentação pronta, o pc resolveu corromper o arquivo... enfim, ossos do ofício de depender do pc.

Tiramos foto no Castelo - símbolo da Fiocruz - junto com o grupo do curso de biotecnologia. Almocei um queijo quente e partimos para o seminário.

O meu grupo foi o segundo. E de fato fiquei nervosa ao ver que nao era só apresentar o seminário e pronto, ninguém faz perguntas, ou poucas perguntas. Nada. Cada um - Rubem, Moema, Alessandrae Mariana - disse conseiderações. Uma apresentação "tese-like". Eu que fui de vestido, até tirei o casaco na hora da minha parte, pois o calor do nervosismo me tomou rs.

Mas no fim de tudo - e já com o certificado na mão - gostei de ter sido assim. Falei para Moema que foi a primeira vez que me senti na frente de uma banca, mas sem a parte ruim (ter o conceito do trabalho). Todas as colocações foram ótimas (e como o Rubem é chato! rs quero ele na minha banca rs) e estão devidamente anotadas no bloquinho...ah, aquele bloquinho vale ouro!

E mesmo cansada, topei ir ao cinema no Bay Market com a Tati e o Felipe (voltamos de carona com o pai do Felipe), pois merecíamos este agrado!

PS.: Para o leitor atento, que reparou que este post e o anterior tem a data de sábado: na quinta, osite do blogger simplesmente resolveu tirar folga e ontem cheguei cansada, e obviamente despenquei na cama.