Em que ponto estamos?

Este post é para situar a que pernas andam meus experimentos no mestrado. Seguem:

1) Pgp: ainda preciso procurar e testar um protocolo que eu consiga des-aderir as células para passar pelo citômetro, mas sem usar EDTA (o EDTA previne a agregação das células, impedindo que elas se grudem como uma bola gigante). Além disso, eu poderia fazer um ensaio rápido para observar se tem (ou não) Pgp nos hemócitos, já que tenho tudo que preciso: já sei como encaixa as lentes do microscópio de fluorescência, e os reagentes - rodamina 123 e verapamil já chegaram (o modelo do experimento está neste post);

2) extração de metalotioneínas: já tenho 10 glândulas digestivas congeladas no freezer -80 graus (agora funcionando direitinho) para testar o protocolo. Os reagentes já chegaram e as soluções necessárias já estão prontas. Já peguei as pastilhas dos inibidores de proteases para testar também e ver se dá pra quelar os metais (ou seja, mantê-los indisponíveis para as proteínas que tem afinidade por metais) da glândula. A partir daí dá pra continuar o protocolo de purificação da metalotioneína para ir para o sequenciamento de proteínas;

3) Experimento da exposição das ostras à cádmio: ainda não comprei a peça que preciso para conectas as duas mangueiras de calibre diferentes. Preciso marcar pra ontem pra fazer este experimento razoavelmente grande, mas não consegui ainda encontrar um período "calmo" - sem disciplinas ou congressos.

4) Bradford: achei no site da sigma um texto explicando como fazer o ensaio, e com informações importantes. também achei no periódico "Current protocols in protein science" um artigo falando de vários métodos colorimétricos, inclusive o Bradford. Já li e estou relendo com mais calma. Também preciso checar os componentes do tampão em que vou manter a proteína, pois a curva padrão teria que ser feita neste mesmo tampão, e alguns componentes possuem limite máximo de concentração para que não ocorra interferências na dosagem.

Mas isso tudo não é prioridade, mas sim fazer o gradiente de percoll (um método para separar as células ) e repetir alguns experimentos de citoquímica, para assim ressubmetermos a short communication.

Zero à esquerda

Meus experimentos na semana retrasada não estavam dando certo. Tinha que aumentar a concentração de cálcio no meio de cultura (L15) e busquei em artigos o quanto eu teria que aumentar. Jurava de pés juntos que a concentração que vi era 6 g/L e assim o fiz. Porém, ao deixar o L15 em repouso por alguns minutos, formava um precipitado, como se fosse uma “nuvem”. Mostrei para o Mauro, que afirmava que não via nada, que era apenas reflexo do plástico.
Fiz os experimentos assim mesmo, e as células em alguns poços simplesmente sumiam – talvez elas lisavam. Eu tirava o meio, lavava, e nada.
Levei os resultados para o orientador, em um gráfico, que não se replicava. Os dados estavam muito ruins, ele nem precisava dizer, eu já sabia disso, mesmo com meus poucos conhecimentos em estatística. Os gráficos não me diziam nada. E ele perguntou “tem certeza que era 6 g/L? Me parece uma concentração muito alta”. Afirmei que sim, mas que em todo o caso procuraria novamente nos artigos. E achei. Acho que preciso trocar os óculos. Havia um zero à esquerda. A concentração era de 0,6 g/L, e não 6 g/L.
O engraçado é que achei em emails antigos eu discutindo a concentração do cálcio, e eu havia dito 0,6 g/L. De onde eu tirei que era 6 g/L?!?!

Quem Descobriu? - O DNA como transmissor da hereditariedade

Nós aprendemos na escola que o responsável pela transmissão da informação genética é a molécula de DNA. Aliás, no CAp (Colégio da Aplicação da UFRJ), a minha “aula inaugural”, chamada de regência, foi sobre mitose e englobou também alguns conceitos envolvendo o DNA: cromossomos, cromátides, compactação do DNA, etc. A aula foi sobre como a célula se divide em duas, e como a sua célula-filha continua tendo o mesmo material genético e em igual quantidade que a célula-mãe. Mas isto será tema de outro post.

Voltando à transmissão da informação genética: é provável que algum aluno mais curioso tenha se perguntado: “mas como eles descobriram que era o DNA?”. Muito simples: fazendo experimentos.

Quem deu o pontapé inicial foi Frederick Griffith, nos anos de 1928 (Detalhe: O DNA já havia sido descoberto nessa época, só a sua estrutura molecular que foi elucidada por Watson e Crick. Pelo amooor de Deus, não foram eles que descobriram o DNA!!!). Ele trabalhava com dois tipos de uma bactéria pneumococus: uma encapsulada que causava infecção em ratos (portanto, era patogênica) e outra não encapsulada, que não causava infecção em ratos. (PS.: Algumas bactérias possuem uma cápsula em torno da sua parede celular). Ele identificava as colônias das bactérias a partir do aspecto das colônias: às não patogênicas chamou de R (do inglês rough, que significa rugoso) e às patogênicas, de S (do inglês smooth, que significa liso). Para facilitar a leitura do texto, vou criar uma legenda: Bactérias R são ñPat. (não patogênicas) e bactérias S são Pat. (patogênicas).

Esse é o F. Griffith

A partir disso, ele fez alguns experimentos. Injetou as bactérias S (Pat.) vivas em camundongos. Como era esperado, os ratos morreram. Em seguida fez o mesmo utilizando as bactérias R (ñPat.) e os ratos sobreviveram. Um terceiro experimento foi injetar as bactérias R (ñPat.) mortas pelo calor. Será que os ratos sobreviveram? Sim, sobreviveram, afinal as bactérias patogênicas foram mortas pelo calor. Então Griffith pegou os “restos” das baterias S (Pat.) mortas pelo calor e misturou com bactérias R (ñPat.) vivas e injetou esta mistura nos ratos. Aposto um doce como os ratos sobreviveram, alguém diria... mas não, os ratos NÃO sobreviveram. Para ter certeza dos resultados, Griffith repetiu várias vezes este mesmo experimento para ter certeza que tudo estava certo. Então ele verificou amostras de sangue dos ratos mortos no último experimento e encontrou as bactérias S (PATOGÊNICAS) vivas. Como foi possível, se antes ele havia injetado as bactérias S mortas pelo calor e os ratos sobreviveram? Havia alguma substância que transformou as bactérias do tipo R no tipo S.

E os responsáveis por desvendar este mistério foram 3 pesquisadores: Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn MacCarty. O ano: 1944. Eles usaram as mesmas bactérias, só que em vez de injetar em ratos, eles faziam culturas delas em placas de Petri, além de trabalhar com extratos celulares destas bactérias (o extrato celular é o líquido que se obtém após romper as células, contendo todas as substâncias presentes). Eles meio que “repetiram” os experimentos de Griffith. Primeiramente, fizeram uma cultura das bactérias R (ñPat.). Em seguida, rompeu as bactérias S (Pat.), ou seja, fez um extrato celular, e adicionou em uma cultura para células. Como era de se esperar, não cresceu nada. Agora eles pegaram as bactérias R (ñPat.), misturaram com extrato celular das bactérias S (Pat.) e preparou a cultura. E as células que cresceram foram...as do tipo S (PATOGÊNICAS)! Viu como foi repeteco do experimento do Griffith? Agora vem a novidade: eles queriam descobrir qual molécula era responsável pela transformação da bactéria R em S. Então eles prepararam o seguinte experimento: misturaram às bactérias R (ñPat.) vivas o extrato da S adicionado de: 1)enzima protease (que degrada proteínas); 2) DNAse (que degrada o DNA) e 3) RNAse (que degrada o RNA). A idéia era a seguinte: se a proteína fosse responsável pela transformação da bactéria, se adicionarmos algo que destrua/acabe/inative com a proteína a bactéria não vai se transformar. Este raciocínio serve também para o DNA e RNA. E então, qual cultura não cresceu bactéria, a de nº 1, nº2 ou nº 3? Respostas no “meus comentários” deste blog, por favor... e com justificativa!

Este é o Oswald Avery

Como montar um experimento???

Dúvidas ó dúvidas...

Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.

Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.

Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!

Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?

Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.

E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...

Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)

Quantas dúvidas, quantas idéias...

O azul de Tripan... They´re not dead!

Sexta fiz o ensaio do azul de tripan. Apesar de eu ter errado num pequeno detalhe – por causa do sono, cansaço e pressa, falei pra ingrid pôr uma ostra para controle 1, uma ostra para tratado 1, 1 ostra pra ctrl 2 e 1 para tratado 2... porém idéia era justamente o contrário, que cada poço de cada trat e ctrl fosse uma ostra diferente, assim teríamos uma variabilidade biológica (certo Mauro?) O experimento foram oito poços ctrl e oito poços tratado com Cd a 1 uM, sendo que 4 ctrl e 4 tratado seriam só para azul de tripan e os outros 4 ctrl e 4 tratado, para Vermelho neutro e depois, o azul d tripan.

De início comecei pelo VN, mas lá pelo terceiro poço, decidi fazer as linhas só do tripan. Afinal, a nossa hipótese era que o Cd estava matando as céls, e por isso q o VN ñ saía do lisossomo para o citosol, ou pior, talvez sequer estivesse entrando na célula. O resultado é que as céls NÃO coraram com o tripan, ou seja, estavam vivas. E o tratado continuou a não corar também. Levei quase três horas pra contar os poços, e quando voltei aos primeiros poços, o VN estava bem mais forte, claro, com vários lisossomos grandes, quase ocupando todo o espaço do citoplasma. Mas tripan, nada. Somente pouquíssimas céls (4 dentre 250, por exemplo) é que coravam com o Tripan, e mesmo assim não eram as céls q estavam aderidas – havia muitas – mas céls muito pequenas, e só tenho certeza de ser céls pq já li vários artigos falando sobre, e na objetiva de 40x dá pra ver.
Bom, sobre o controle do “somente” tripan, tive outro problema: como esse controle foi feito com uma ostra somente, havia céls estranhas, grandes, com grânulos muito também grandes e amarelados, e que estavam espraiadas antes de adicionar o corante. O curioso é que após adicionar o corante, elas adquiriam a forma arredondada. E tive a impressão que elas espraiaram de novo após retirada do corante. Interessante, mas me serviu de nada pois não corou com tripan, e esqueci de pôr o VN só de curiosidade (a fome tava dilacerante e queria pegar o finzinho do coffee-break do ministro; tadinha, quando cheguei só sobrou um mísero copo de refri). Esse tipo celular me aparecia bastante quando eu tava iniciando as culturas, até já comentei com a Barracco, e provavelmente deve ser algum parasita. Ia tirar foto, mas ALGUÉM desconectou a plaquinha da câmera do laptop, ou pior, tirou o pininho amarelo (que conecta a câmera na placa) da placa. Tentei encaixar mas não ficava, parecia que faltava uma pecinha, que estava quebrada.
Enfim, gostaria de fazer mais uma placa pra ratificar que esse Cd não está atingindo as céls, pelo que parece, já que o ctrl tava bichado. Mas assumindo que isso seja ratificado, agora a questão é? Por quê? O mauro falou que possivelmente as substâncias contidas no meio de cultura estariam quelando o Cd, deixando-o indisponível ao contato com a cél, logo não estaria fazendo “efeito”. Tudo bem, mas isso não justifica que o tratado esteja totalmente livre do corante. Se o Cd está indisponível, ao menos as cels deveriam se parecer com o ctrl, o que não ocorre tanto na coloração do VN quanto na morfologia. (Aliás, a coloração do ctrl é discutível em outro tópico). Eu poderia fazer uns testes aumentando a concentração do Cd, e fazer em paralelo (não por cima) o VN e o tripan.
Outra coisa que me ocorreu é de aquela solução de Cd já estar com “o prazo de validade vencido”; por exemplo, a tampinha do vidro de H2O2 a 10mM já briu sozinha tantas vezes que ali deve ter só água rsrsrs. Lembro de uma conversa com o Rodrigo no avião, voltando de Floripa, ele me dizendo para trocar os reagentes, soluções, etc, fazer tudo novo.
E por falar em soluções, tenho que verificar a salinidade do tripan. Eu fiz a 0,4% em PBS, como tá na literatura, mas salinidade é 1 problema sério para nossas céls, apesar de na sexta não ter visto nada de anormal (a não ser as céls estranhas encolhendo). Talvez eu tenha que fazer um tripan novo, com o PBS ajustado à salinidade.
Outra coisa que me preocupa também é as ostras lá no aquário. Ando muito relapsa, sem verificar a salinidade e pH (apesar de não ver a importância desse parâmetro muito discutido) e TEMPERATURA. Muitas vezes ia pegar umas ostras e a água tava bem quente, principalmente na segunda, após fim de semana. A Ju sugeriu de ela trazer um aquariozinho para colocar umas ostras e deixar na 32, com o ar ligado, pra ver se há alguma diferença, ou fazer isso também quando chegar ostras novas. That´s all, folks!