Como montar um experimento???

Dúvidas ó dúvidas...

Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.

Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.

Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!

Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?

Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.

E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...

Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)

Quantas dúvidas, quantas idéias...

Dúvidas...

Bom, não publiquei antes porque a seqüência “seminário-prova + estudo dirigido de evolução-relatório do estágio” me deixou sem tempo. Mas aqui estou.
Na segunda fiz uns pocinhos para corar com o Tripan. Na terça, após o seminário, fui contar. Perdi os dois primeiros pocinhos do ctrl pq a burra aqui esqueceu de filtrar o Tripan, então mal dava pra achar cel no meio de tanta sujeira, de tanto particulado. Ao dotal fiz 8 poços ctrl e 8 poços tratado com Cd a 1 uM. E o resultado de ambos foi parecido (preciso aprender de vez a fazer gráfico no Statistic!). Uns poços coravam mais (ao em torno de 89 coradas p/ 200 e poucos ñ coradas), outros menos (20 coradas para os mesmos 200 e tanto). Ou seja, o Cd de fato não está matando as céls. E as que coravam eram muuuito pequenininhas. E cada vez mais me convenço que certas céls lá não são hemócitos, mas sim algum tipo de contaminante. Preciso ligar aquela câmera já!!!

Outra coisa interessante que “descobri” enquanto esperava corar o poço: pequei no L-15, com as cels soltas que eu imaginava ter, claro, e pus em um poço limpo. De fato, tinha várias céls, mas o interessante é que elas me pareceram aderir, e algumas até a dar uma leve espraiada. (Para saber se a cel tá solta ou não, dou uma sacudida de leve na mesa; se ela se mexe, é porque está em solução, ou seja, solta). Isso é bom pra mim, pois quando precisar tirar fotos boas, seja da própria cél, ou ela corada com o VN, o Tripan, etc, basta colocar em uma lâmina e fotografar no maravilhoso mic da Sil.
Mas o que me intriga é: a cél tava solta; então pus em outro poço, limpo, e logo ela aderiu...ou seja, ela pode até ta baleada com Cd (este testezinho fiz com as céls tratadas), mas ela ainda tem essa capacidade de aderir...

Às vezes fico divagando com essas coisas. Você estudar um determinado objeto, e mesmo que já tenha todo o planejamento do que estudar, do que focar, sempre vai aparecer algo inesperado, como uma pequena tentativa dessa que fiz – eu achava que cél solta era cél f**, morta, etc – ou algum erro que gerou um resultado intrigante (quem não lembra da penicilina? O Eureka! Que o Mauro me emprestou mostra que tantas descobertas foram feitas por acaso!) – E o que fazer quando isso acontece? Desvia dos teus objetivos, parcial ou totalmente, ou ignora, e continua no previamente caminho traçado? Temos que ter foco, claro, mas até quando ele deve ser respeitado?

" O acaso só favorece aos espíritos preparados e não prescinde da observação".

... Ficou rosa!!!

Nem ia escrever hj, mas depois do cochilo maravilhoso que tirei no ônibus (o piloto apagou todas as luzes! aquele buzu maravilhoso, poltrona acolchoada...) me animei.

Hoje fiz uma placa (16 poços, somente) só para ver tripan. A concentração de Cd que usei foi a mesma, de 1 uM. Sobrou um restinho de L15, então resolvi pôr em prática uma idéiazinha hehehe (Mauro, não briga rs)

Já que o L-15 tem phenol red, que é um indicador d pH, e a coloração fica amarela em pH ácido (por volta de 6), será que seu adicionar NaOH vai voltar a ficar vermelho?

Então, pequei o restinho de meio que sobrou, adicionei o cloreto de cádmio para que ficasse a

1 uM (como sempre faço). Cor: amarelo. Peguei a solução de NaOH a 1 M e adicionei 20 uL. INSTANTANEAMENTE ficou.... da cor da flor aí do lado. Claro que não era a cor que eu queria, mas mostra que se o pH mudar de novo, o indicador também muda. O que siginifica que posso usar para ajustar o pH com o NaOH, sem necessitar de fitinha ou ter que mergulhar o eletrodo do pHmetro no meio com Cd. Só diluir um pouco o NaOH (1 M é muito contrado) e ver o menor volume possível para adicionar ao meio, sem alterar muito o volume inicial.

O azul de Tripan... They´re not dead!

Sexta fiz o ensaio do azul de tripan. Apesar de eu ter errado num pequeno detalhe – por causa do sono, cansaço e pressa, falei pra ingrid pôr uma ostra para controle 1, uma ostra para tratado 1, 1 ostra pra ctrl 2 e 1 para tratado 2... porém idéia era justamente o contrário, que cada poço de cada trat e ctrl fosse uma ostra diferente, assim teríamos uma variabilidade biológica (certo Mauro?) O experimento foram oito poços ctrl e oito poços tratado com Cd a 1 uM, sendo que 4 ctrl e 4 tratado seriam só para azul de tripan e os outros 4 ctrl e 4 tratado, para Vermelho neutro e depois, o azul d tripan.

De início comecei pelo VN, mas lá pelo terceiro poço, decidi fazer as linhas só do tripan. Afinal, a nossa hipótese era que o Cd estava matando as céls, e por isso q o VN ñ saía do lisossomo para o citosol, ou pior, talvez sequer estivesse entrando na célula. O resultado é que as céls NÃO coraram com o tripan, ou seja, estavam vivas. E o tratado continuou a não corar também. Levei quase três horas pra contar os poços, e quando voltei aos primeiros poços, o VN estava bem mais forte, claro, com vários lisossomos grandes, quase ocupando todo o espaço do citoplasma. Mas tripan, nada. Somente pouquíssimas céls (4 dentre 250, por exemplo) é que coravam com o Tripan, e mesmo assim não eram as céls q estavam aderidas – havia muitas – mas céls muito pequenas, e só tenho certeza de ser céls pq já li vários artigos falando sobre, e na objetiva de 40x dá pra ver.
Bom, sobre o controle do “somente” tripan, tive outro problema: como esse controle foi feito com uma ostra somente, havia céls estranhas, grandes, com grânulos muito também grandes e amarelados, e que estavam espraiadas antes de adicionar o corante. O curioso é que após adicionar o corante, elas adquiriam a forma arredondada. E tive a impressão que elas espraiaram de novo após retirada do corante. Interessante, mas me serviu de nada pois não corou com tripan, e esqueci de pôr o VN só de curiosidade (a fome tava dilacerante e queria pegar o finzinho do coffee-break do ministro; tadinha, quando cheguei só sobrou um mísero copo de refri). Esse tipo celular me aparecia bastante quando eu tava iniciando as culturas, até já comentei com a Barracco, e provavelmente deve ser algum parasita. Ia tirar foto, mas ALGUÉM desconectou a plaquinha da câmera do laptop, ou pior, tirou o pininho amarelo (que conecta a câmera na placa) da placa. Tentei encaixar mas não ficava, parecia que faltava uma pecinha, que estava quebrada.
Enfim, gostaria de fazer mais uma placa pra ratificar que esse Cd não está atingindo as céls, pelo que parece, já que o ctrl tava bichado. Mas assumindo que isso seja ratificado, agora a questão é? Por quê? O mauro falou que possivelmente as substâncias contidas no meio de cultura estariam quelando o Cd, deixando-o indisponível ao contato com a cél, logo não estaria fazendo “efeito”. Tudo bem, mas isso não justifica que o tratado esteja totalmente livre do corante. Se o Cd está indisponível, ao menos as cels deveriam se parecer com o ctrl, o que não ocorre tanto na coloração do VN quanto na morfologia. (Aliás, a coloração do ctrl é discutível em outro tópico). Eu poderia fazer uns testes aumentando a concentração do Cd, e fazer em paralelo (não por cima) o VN e o tripan.
Outra coisa que me ocorreu é de aquela solução de Cd já estar com “o prazo de validade vencido”; por exemplo, a tampinha do vidro de H2O2 a 10mM já briu sozinha tantas vezes que ali deve ter só água rsrsrs. Lembro de uma conversa com o Rodrigo no avião, voltando de Floripa, ele me dizendo para trocar os reagentes, soluções, etc, fazer tudo novo.
E por falar em soluções, tenho que verificar a salinidade do tripan. Eu fiz a 0,4% em PBS, como tá na literatura, mas salinidade é 1 problema sério para nossas céls, apesar de na sexta não ter visto nada de anormal (a não ser as céls estranhas encolhendo). Talvez eu tenha que fazer um tripan novo, com o PBS ajustado à salinidade.
Outra coisa que me preocupa também é as ostras lá no aquário. Ando muito relapsa, sem verificar a salinidade e pH (apesar de não ver a importância desse parâmetro muito discutido) e TEMPERATURA. Muitas vezes ia pegar umas ostras e a água tava bem quente, principalmente na segunda, após fim de semana. A Ju sugeriu de ela trazer um aquariozinho para colocar umas ostras e deixar na 32, com o ar ligado, pra ver se há alguma diferença, ou fazer isso também quando chegar ostras novas. That´s all, folks!