Em que ponto estamos?

Este post é para situar a que pernas andam meus experimentos no mestrado. Seguem:

1) Pgp: ainda preciso procurar e testar um protocolo que eu consiga des-aderir as células para passar pelo citômetro, mas sem usar EDTA (o EDTA previne a agregação das células, impedindo que elas se grudem como uma bola gigante). Além disso, eu poderia fazer um ensaio rápido para observar se tem (ou não) Pgp nos hemócitos, já que tenho tudo que preciso: já sei como encaixa as lentes do microscópio de fluorescência, e os reagentes - rodamina 123 e verapamil já chegaram (o modelo do experimento está neste post);

2) extração de metalotioneínas: já tenho 10 glândulas digestivas congeladas no freezer -80 graus (agora funcionando direitinho) para testar o protocolo. Os reagentes já chegaram e as soluções necessárias já estão prontas. Já peguei as pastilhas dos inibidores de proteases para testar também e ver se dá pra quelar os metais (ou seja, mantê-los indisponíveis para as proteínas que tem afinidade por metais) da glândula. A partir daí dá pra continuar o protocolo de purificação da metalotioneína para ir para o sequenciamento de proteínas;

3) Experimento da exposição das ostras à cádmio: ainda não comprei a peça que preciso para conectas as duas mangueiras de calibre diferentes. Preciso marcar pra ontem pra fazer este experimento razoavelmente grande, mas não consegui ainda encontrar um período "calmo" - sem disciplinas ou congressos.

4) Bradford: achei no site da sigma um texto explicando como fazer o ensaio, e com informações importantes. também achei no periódico "Current protocols in protein science" um artigo falando de vários métodos colorimétricos, inclusive o Bradford. Já li e estou relendo com mais calma. Também preciso checar os componentes do tampão em que vou manter a proteína, pois a curva padrão teria que ser feita neste mesmo tampão, e alguns componentes possuem limite máximo de concentração para que não ocorra interferências na dosagem.

Mas isso tudo não é prioridade, mas sim fazer o gradiente de percoll (um método para separar as células ) e repetir alguns experimentos de citoquímica, para assim ressubmetermos a short communication.

Não existe Pgp?!

Estava relembrando como as células irão (espero eu) se comportar nos experimentos para verificar a atividade de uma proteína que “expulsa” diversas substâncias potencialmente nocivas à célula: a glicoproteína P (cuja abreviação é Pgp). Basicamente, o experimento funciona na seguinte maneira: em uma cultura de células, você adiciona um determinado corante fluorescente (no caso a rodamina B)Se essas células possuírem a Pgp, essa proteína vai “expulsar” o corante do interior da célula e ela pouco fluoresce (para fluorescência, é possível conferir se a célula fluoresce observando-as no microscópio; para quantificar a fluorescência, as células são “lidas” por um aparelho próprio, o citômetro de fluxo). Se é adicionado um inibidor dessa proteína, esta pára de “expulsar” o corante de dentro da célula, que passa a apresentar alta fluorescência (observe o esquema que fiz, abaixo).

Esquema simplificado do funcionamento da Pgp ao adicionarmos o corante Rodamina B

Este ensaio também serve para deduzir se uma determinada substância é ou não expulsa da célula pela Pgp. Se adicionarmos algum poluente, por exemplo o cádmio (sempre puxando sardinha para meu lado rs) e a fluorescência for baixa, significa que o cádmio não é expulso pela Pgp, já que ela estará expulsando o corante. Já se a fluorescência for alta, há duas explicações: 1) o cádmio um substrato para a Pgp (ou seja, a proteína vai expulsar menos corante para também expulsar o cádmio) ou 2)o cádmio é um inibidor da PGP (a proteína expulsa nenhum dos dois compostos)

Bom, e eu preocupada relembrando esses detalhes para analisar os resultados. E ainda nem estabeleci um protocolo de experimentos. Após conseguir manter as células “separadas”, isto é, sem formar agregados usando uma solução anti-agregante, o Rapha me aconselhou a não usar esse tipo de solução quando fizer os ensaios para Pgp, especialmente por conter EDTA, uma substância que torna indisponível cálcio e magnésio para a célula (muito importantes em diversas reações celulares). Eu tinha 2 opções:

1) fazer o ensaio com as células aderidas na placa. Complicação: o uso de tripsina pode danificar seriamente as células.
2) Fazer o ensaio com as células em suspensão. Complicação: como eu não poderia usar o anti-agregante, as células agregariam absurdamente. Além disso, teria que fazer mais centrifugações para retirar e lavar o corante, o que aumentaria mais ainda a agregação.

Procurando na literatura protocolos deste experimento, descubro que a grande maioria (22 de 24 trabalhos listados na base de dados pubmed) utilizam tecidos como brânquia e glândula, e não hemócitos. Apenas 2 trabalhos abordavam hemócitos. Mas em vez de ajudar, fiquei preocupada, especialmente o de Sversson (2003), que não encontrou atividade da Pgp em hemócitos do mexilhão Mytilus edulis, apesar de outro autor (Minier, 1996) ter encontrado uma proteína com mesmo peso molecular de Pgp e reação positiva para um anticorpo anti-Pgp de humano. (Thiago, isto te lembra algo?!)

Fica a pergunta para ser respondida daqui a alguns dias: será que há atividade de pgp nos hemócitos que eu estudo?