Não existe Pgp?!

Estava relembrando como as células irão (espero eu) se comportar nos experimentos para verificar a atividade de uma proteína que “expulsa” diversas substâncias potencialmente nocivas à célula: a glicoproteína P (cuja abreviação é Pgp). Basicamente, o experimento funciona na seguinte maneira: em uma cultura de células, você adiciona um determinado corante fluorescente (no caso a rodamina B)Se essas células possuírem a Pgp, essa proteína vai “expulsar” o corante do interior da célula e ela pouco fluoresce (para fluorescência, é possível conferir se a célula fluoresce observando-as no microscópio; para quantificar a fluorescência, as células são “lidas” por um aparelho próprio, o citômetro de fluxo). Se é adicionado um inibidor dessa proteína, esta pára de “expulsar” o corante de dentro da célula, que passa a apresentar alta fluorescência (observe o esquema que fiz, abaixo).

Esquema simplificado do funcionamento da Pgp ao adicionarmos o corante Rodamina B

Este ensaio também serve para deduzir se uma determinada substância é ou não expulsa da célula pela Pgp. Se adicionarmos algum poluente, por exemplo o cádmio (sempre puxando sardinha para meu lado rs) e a fluorescência for baixa, significa que o cádmio não é expulso pela Pgp, já que ela estará expulsando o corante. Já se a fluorescência for alta, há duas explicações: 1) o cádmio um substrato para a Pgp (ou seja, a proteína vai expulsar menos corante para também expulsar o cádmio) ou 2)o cádmio é um inibidor da PGP (a proteína expulsa nenhum dos dois compostos)

Bom, e eu preocupada relembrando esses detalhes para analisar os resultados. E ainda nem estabeleci um protocolo de experimentos. Após conseguir manter as células “separadas”, isto é, sem formar agregados usando uma solução anti-agregante, o Rapha me aconselhou a não usar esse tipo de solução quando fizer os ensaios para Pgp, especialmente por conter EDTA, uma substância que torna indisponível cálcio e magnésio para a célula (muito importantes em diversas reações celulares). Eu tinha 2 opções:

1) fazer o ensaio com as células aderidas na placa. Complicação: o uso de tripsina pode danificar seriamente as células.
2) Fazer o ensaio com as células em suspensão. Complicação: como eu não poderia usar o anti-agregante, as células agregariam absurdamente. Além disso, teria que fazer mais centrifugações para retirar e lavar o corante, o que aumentaria mais ainda a agregação.

Procurando na literatura protocolos deste experimento, descubro que a grande maioria (22 de 24 trabalhos listados na base de dados pubmed) utilizam tecidos como brânquia e glândula, e não hemócitos. Apenas 2 trabalhos abordavam hemócitos. Mas em vez de ajudar, fiquei preocupada, especialmente o de Sversson (2003), que não encontrou atividade da Pgp em hemócitos do mexilhão Mytilus edulis, apesar de outro autor (Minier, 1996) ter encontrado uma proteína com mesmo peso molecular de Pgp e reação positiva para um anticorpo anti-Pgp de humano. (Thiago, isto te lembra algo?!)

Fica a pergunta para ser respondida daqui a alguns dias: será que há atividade de pgp nos hemócitos que eu estudo?

Quando a união não faz a força

Trabalhar com células possui seus percalços, que variam de acordo com cada tipo celular. Os hemócitos não fogem à regra. A Paulinha trabalha com hemócitos de caranguejo, e eu com hemócitos de ostra. E compartilhamos um mesmo problema: a agregação (ou coagulação) destas células. Logo que fazemos a punção dos hemócitos, eles se unem em uma maçaroca de células, com a qual não é possível fazer nada. Um grande empecilho. A Paulinha sofre mais que eu: "meus" hemócitos agregam bem menos que os "dela".
Semana passada passei as células no citômetro de fluxo para tentar identificar as populações de hemócitos, necessária para seguir com meus experimentos. Mas a agregação dos hemócitos foi um problema sério. Isso acontece principalmente porque preciso fazer uma centrifugação a fim de concentrar as células e ressuspendi em um meio de cultura, o L-15.
Resultado. Agregou geral.
Em seguida, testei ressuspender as células em uma solução bem conhecida pelo pessoal que trabalha com hemócitos: o antiagregante,que, como o nome diz, impede a agregação. Bingo! células livres, leves e soltas. Resultado. no citômetro, a identificação das células ficou bem melhor.

Artigos russos

No filme “bonecas Russas”, Xavier reflete que sua vida amorosa se assemelha àquelas bonequinhas típicas da Rússia, as Matrioshkas, onde dentro de cada boneca existe uma menor. A busca de informações nos artigos também segue a lógica da bonecas russas: você acha um artigo com alguma informação do seu interesse, mas este cita outro artigo. Você busca a segunda citação, e este cita um terceiro. E quando você acha que o terceiro é o último...bem, pode existir um quarto, ou não nenhum. Mas o pior é quando a informação que você tanto procurava não está em nenhum daqueles que você procurou.

Eu queria comparar como Cao (2003) preparou uma cultura primária de hemócitos de Mytilus galloprovinciallis. Começou nos materiais e métodos com a indicação “segundo Barcia et al. 1999” e fez uma descrição rápida dos procedimentos. Segui esta referência, que me levou ao Hughes et al. (1990) que citava mais um autor cujo trabalho não encontrei nos sites de busca. Em Barcia e Hughes, estava descrito exatamente a mesma preparação que em Cao. Não havia as informações que eu buscava:se as células eram centrifugadas, qual a velocidade e em qual solução seriam ressuspendidas. Em Barcia, há uma centrifugação de 3000 x g com ressuspensão em um tampão para lisar as células. Portanto, esta centrifugação não era para manter as células vivas.

Mas voltando o que me interessou no artigo de Cao. Manter cultura primária de hemócitos (ou melhor, invertebrados como um todo) é muito difícil, principalmente porque não se sabe exatamente quais nutrientes estas células necessitam para sobreviver. Neste artigo, ele consegue manter as células vivas (em torno de 100%), por cerca de 20 dias, o que é um tempo muito bom.

Fig. 1: gráfico de sobrevivência de hemócitos em fungicida (bolinha = 1ug/mL; triângulo: 0,5ug/mL; quadrado: 0,1ug/mL) e em soro fetal bovino (A) e hemolinfa (B)

Neste gráfico, ele analisou o efeito de um fungicida em 3 concentrações diferentes de um fungicida e de duas substâncias que melhoriam a cultura de células: (A) soro fetal bovino – muito usado em culturas de vertebrados por conter diversos componentes (como vitaminas, proteínas, carboidratos, etc) necessários para a sobrevivência das células – e (B) hemolinfa inativada (é como se fizesse um análogo do soro fetal bovino: a hemolinfa foi aquecida, centrifugada e filtrada).
Das três concentrações, a menor concentração do fungicida (0,1µg/mL) apresentou melhor resultado. Com 100% das células viáveis por 20 dias em presença de soro. Quando adicionada a hemolinfa, e esse valor subiu para 25 dias. O curioso é que a concentração de 10 µg/mL é muito comum em culturas de vertebrados, e causa morte de 50% das células após 5 dias de cultura. Por isso que, se trabalhando com invertebrados, sempre temos que adaptar nosso protocolo.
Nas minhas culturas de hemócitos, eu uso uma concentração de 10 µL/mL do antibiótico penicilina-estreptomicina e não utilizo soro nem hemolinfa para complementar o meio de cultura. E olha que esta concentração já foi mais alta, de 100 µL/mL, mas diminuí após sugestão de conversar com uma menina que apresentava trabalho em um congresso que fui.
Tudo bem, as células estão vivas. Mas será que estão saudáveis? Para mim que trabalho com ensaios de toxicologia, até que ponto determinado efeito é causado por um poluente e não pelo fato de as células estarem débeis (doentes)? Por isso que existem diversos ensaios para conferir a “saúde” das células, como a fagocitose, uso de diversos corantes (como o meu vermelho neutro) entre outros. No artigo, ele utilizou como ensaio a quantificação de uma proteína que é envolvida na fagocitose. Então, ele determinou que 3 dias de cultura seria o ideal para fazer este ensaio. Trocando em miúdos: às vezes, não é de grande valor manter a cultura por longos períodos, se o ensaio, teste, however, o seu objetivo não é eficiente em culturas longas.

Poli-lisina e aderência celular

AS células sempre procuram um substrato para aderir, não costumando ficar em suspensão em uma solução. Este substrato pode ser placas de petri, lâminas, lamínulas... Aliás, a desaderência pode ser até indício de que a célula está entrando em morte celular programada, também conhecida como apoptose.

E alguns tipos celulares são danados para não aderir. Ou melhor, elas ficam aderidas por um (pouco) tempo, de algumas horas, mas se é preciso fazer experimentos com exposição de drogas por períodos muito longos, algo como 24h, 48h, 72h com o passar do tempo o número de células aderidas pode diminuir substancialmente.

Para melhorar esta adesão, existem substâncias que são muito empregadas nos laboratórios, como colágeno e laminina, que são proteínas de matriz extracelular (é o material que fica em volta das células, que mantêm a aderência entre as células, formando tecidos, além de outras funções). Elas em geral atuam por atrações de carga: como o lado externo da célula possui carga líquida positiva, estes compostos possuem carga negativa. Inclusive li um trabalho que comparava qual seria a melhor substância para melhorar a adeão celular. E a campeã foi a poli-D-lisina.

A polilisina é um polímero (por isso o prefixo poli) feito do aminóacido lisina. Em outras palavras, é uma lisina "amarrada" na outra. Se a o grupo carboxila do aminoácido lisina "estiver" (na verdade este conceito é muito complexo para explicar am poucas linhas) na esquerda, teremos a poli-L-lisina. E se "estiver" na direita, teremos poli-D-lisina. Sendo que, na natureza, só encontramos proteínas formadas com aminoácidos na forma L.

Sempre usei poli-L-lisina para melhorar a aderência das minhas células, o que de fato ocorre. Porém lendo um artigo que a Ju me enviou, os autores usaram a versão D, sendo que em todos os artigos já lidos por mim a forma usada era a L. Mais tarde, pesquisando no site da Sigma-Aldrich, uma empresa que vende produtos para laoratório, estava escrito na seção FAQ a diferença: como a forma L é encontrada na natureza, alguns tipos celulares podem digeri-la, através de proteases. Nestes casos, a forma D seria a mais recomendada.

Então veio a pergunta: será que meus hemócitos estariam digerindo a poli-L-lisina? Será que eles secretam proteases? Sim, é possível, já que são células circulantes na hemolinfa, e responsáveis pelas respostas de defesa contra patógenos. Mas para não ficar no "achismo", busquei artigos que tivessem feito algum tipo de reação para proteases. Achei um trabalho que fazia detecção de diversas enzimas, entre elas...proteases.

Outro detalhe: buscando mais informações sobre polilisinas, vejo uma pergunta sobre a poli-L-lisina que uso:

- "A polilisina P8920 (nº do catálogo) pode ser usada para cultura de células?"

- "NÃO (grifo meu), pois ela contém 0,01% de timerosal, que é um conservante. Este produto é indicado para aderência de tecidos em lâminas. Para culturas de células, deve ser usado o produto PXXXX que é similar mas sem o conservante".

Ainda, mas ainda bem que não consegui encomendar a poli-L-lisina...

Happy!!!!

Primeiramente:
Passeeeeeeei no mestrado! Agora serei uma pós-graduanda !!! (só falta fazer a matrícula)

Segundo, este post é para tentar clarear algo que está tirando meu sono há algum tempo: os granulócitos da ostra que trabalho, Crassostrea rhizophorae.
A única caracterização morfológica dos hemócitos foi feito por Tânia Barth sob orientação da Marguerita Barracco, a quem tive o prazer de conhecer e traballhar em seu lab por alguns dias.
Ela fez a microscopia óptica dos hemócitos, corando com o corante Giemsa. Nela, ela achou três tipos de hemócitos: um sem grânulos, (hialino), com pouco citoplasma e núcleo grande. Outro hialino mas com muito citoplasma e núcleo menor. E o granulócito, que contêm grânulos no citoplasma. Só que o que vejo nas minhas células é um granulócito com grânulos bem maiores que os dela. Mas ao procurar imagens dos meus granulócitos, achei céls com grânulos parecidos (veja as fotos abaixo):

Hemócitos de C. rhizophorae. a: granulócito da Barracco; b: granulócito semelhante ao da Barracco e c:granulócito diferente ao da Barracco.

Sobre os hemócitos da figura c, pensei em duas hipóteses:

1) que, na verdade, são células de parasitas (protozoários, amebas, etc);
2) são células do músculo, e não da hemolinfa;

Mas ao ler um artigo que o João me enviou, lá de um pessoal da França, vi que na população de hemócitos pode aumentar a porcentagem de granulócitos. Apesar de ele estar se referindo a experimentos com exposições de xenobióticos em culturas in vitro (provavelmente esse aumento ocorreu devido à morte de hialinócitos), isto me deu uma luz. Os granulócitos podem aumentar de freqüência na hemolinfa! Inclusive eu já vi trabalhos que fizeram contagem diferencial em diferentes estações do ano para quantificar possíveis mudanças. Então pensei em mais uma hipótese:

3) manter as ostras no aquário faz que a população de granulócitos aumente além de mudar a morfologia dos grânulos, fazendo com que fique maiores.

Eu penso que esta seja a mais coente porque: i) não observava este tipo celular logo assim que as ostras chegavam; ii) a Barracco mantinhas as ostras no aquário por no máximo 48h.

Vou buscar artigos que falem sobre estas alterações dos hemócitos em bivalves que estejam sob condições de laboratório em outras espécies, além de verificar isto na próxima chegada de ostras. Aliás, manter este aquário descente está difícil, mas vou conseguir!

ah, Por que você está chorando?

Já que eu falei de choro, me perguntei: por que as mulheres choram mais do que os homens? Dei uma procurada nos bancos de dados em busca de uma resposta científica, e como não achei nada, busquei no bom e velho Google. Não achei a resposta para a pergunta inicial, as encontrei o nome de William Frey, professor de psiquiatria de Farmácia da Universidade de Minnesota. Ele trabalha com Alzheimer, com disponibilidade de drogas, barreira hemato-encefálica... e choro e seus benefícios para a saúde. Não encontrei nenhum artigo so Frey nos bancos de dados sobre esse tema, mas no Google havia dois artigos de divulgação cientifica falando desssa linha de pesquisa. Fico meio desconfiada deste tipo de informação, especialmente porque estes jornalistas tendem a distorcer (propositadamente ou por falta de conhecimento) os resultados das pesquisas.

Bom, as lágrimas, de um modo geral, não possui vantagem evolutiva em humanos, além daquela de lubrificar os olhos. Quem passa muito tempo no ar condicionado sabe como é incômodo a secura dos olhos. Além de conter enzimas que são bactericidas. Sem elas, as bactérias as quais estamos constantemente expostos nos cegariam. Mas somente humanos choram (será?). E que isto teria sim, uma vantagem. Vantagem de sobrevivência.

Como? Sob tensão ou stress intenso, homens gritam, berram, brigam, batem. Mulheres choram. E este choro que seria “saudável”, exatamente por liberar tensões e dar alívio a aqueles que derramam lágrimas. E como é bastante divulgado (acho até além da conta) que stress aumenta os riscos de ataque cardíaco e danos em determinadas áreas do cérebro, chorar possui sim uma vantagem; seria uma estratégia de sobrevivência.
O choro literalmente “desestressa”, além de encorajar comportamentos em grupo, melhorar o apoio social e inibir a agressividade. Quem nunca viu uma moça chorosa sendo consolada por diversas amigas? Presenciei uma situação dessas no CAp. Uma aluna chorava pois havia sido suspensa (por justa causa) e as meninas na sala, até aquelas que não falavam com ela, foram consolá-la.

Um experimento que a equipe do Frey realizou foi comparar a composição das lágrimas do choro provocado por cebolas (detesto cortar cebola por causa disso) e por choro provocado por filmes tristes – as chamadas lágrimas emocionais. Neste segundo grupo, as lágrimas continham maior quantidade de substâncias nocivas, o que poderia indicar que o “choro emocional” seria um meio de o organismo se livrar de substâncias nocivas cuja síntese foi desencadeada por stress emocional.

Bom, aqui está o link dos 2 sites que visitei. Um deles é de “divulgação religiosa”, digamos, por isso desconsidere o modo emotivo como está escrito a reportagem...

http://www.rxpgnews.com/mental-health/Shed-tears-to-stay-healthy_128145.shtml

http://www.answersingenesis.org/creation/v15/i4/tears.asp

Choro em números:

20% das crises de choro duram mais do que 30 minutos;
8% continuam por mais de uma hora;
70% dos que choram não se esforçam em esconder o choro;
77% dos que choram fazem isso em casa...
...e 15% o fazem no trabalho ou em casa;
40% choram sozinhas;
39% dos choros acontecem no início da noite, ultrapassando a porcentagem dos casos que ocorrem pela manhã, de tarde ou à noite;
O horário mais comum para chorar é entre 18h e 20h;
88,8% se sentem melhor depois de ter chorado;
A mulher chora em média 47 vezes por ano;
Já os homens choram em média 7 vezes por ano.

Portanto, homens, vocês devem chorar mais vezes! Deve ser por isso que vivemos mais :D
Outra dica: nunca falem para uma mulher que esteja chorando que ela está nervosa, que é frescura, drama, etc pois além de piorar a situação, isto nos irrita!

TPM

Semana passada eu estava de TPM. Não, não é Tensão Pré Menstrual, mas sim Tensão Pré-Mestrado ou então Tensão Pós Mauro (perdoe o trocadilho, querido ;).
Terça foi minha defesa do projeto de mestrado. O último passo para deixar o limbo da Iniciação Científica e me tornar pós-graduanda. Apresentar e defender um projeto em 15 minutos para uma banca de 3 professores.
Após quase duas semanas preparando a apresentação de Power point, tentando pensar com minha cabeça e com a cabeça do chefe, depois de muita conversa, esclarecimentos e ajuda do orientador, às 15:20 do dia da apresentação, que seria às 16:15, o arquivo ficou 100% pronto. É incrível como cada vez que eu (ou o Mauro) abria o arquivo, achávamos algo a mudar, algo a melhorar, a acrescentar ou retirar.
Fiquei até 7 e meia da noite do dia anterior no lab para finalizar tudo. Demorei a tarde inteira (de 2 às 5 e pouca, praticamente) para fazer um fluxograma do desenho experimental e um modelo de cronograma que sequer passava pela minha cabeça como era – até o chefe ver que eu não ia sair mesmo e me ensinou como fazia. Queria provar que conseguia fazer um fluxograma “à mão livre”, mas não teve jeito e recorri aos modelos prontos do Power point. Ah se eu tivesse ouvido the advice...
Bom, às 6 e pouca a Silvana (minha outra orientadora) bateu lá no lab, e fiz uma apresentação oral para os dois. Corrigimos detalhes, fiz anotações, ouvi diversos conselhos e isto foi me dando confiança. Mas como cheguei em casa tarde e estava cansada e sem dormir direito há três noites, deixei para ensaiar de manhã, e me gravei duas vezes.
Estava calma. Até às 15:35.
Quando uma mulher some antes de um momento importante ou quando ela está sob pressão, o primeiro lugar a procurar é o banheiro. Ou ela vai estar com dor de barriga, ou passando mal...ou chorando.
Subi para aguardar a apresentação, levando a tira colo meus papéis de origami, já que reza a cartilha que toda apresentação demora. Mas não foi assim que aconteceu. Logo que subi a escada topei com a Cíntia, uma amiga que iria antes de mim. Pensei: ah, atrasaram como o previsto. Mas ela me disse: “já fui, a minha acabou mais cedo. Agora é você”. Dez segundos após ela falar “fica calma que eles vão te chamar”, a porta se abriu. “Você que é Eliane? É a sua vez”.
Entrei descontraidamente, conversei com os professores enquanto espetava o pen drive no laptop. E comecei. Se na gravação eu falei em 11 minutos, devo ter terminado a apresentação em 7 min. Falei que MXR era canal. Devo ter cometido todos os erros de concordância possíveis. Mas a parte das perguntas foi o pior. No início me perguntaram como eu cultivava as céls, como eu as extraía do bicho, até aí tudo bem. Até a pergunta que me desmoronou: “sua cultura tem dois tipos celulares. Você acha que isto não poderia mascarar os seus resultados?” Tive a coragem de perguntar “como assim, não entendi” e a outra professora tentando me ajudar, repetindo com mais detalhes o que o primeiro falou.
E depois ela: “então você vai fazer faloidina para ver se o Cd despolimeriza a actina. Isto já tem na literatura?” Trocando em miúdos: pq vc vai fazer isto se já tem na literatura q já fizeram?! Tentei argumentar depois que pode ser que o Cd cause despolimerização do filamento ou então que pode ocorrer uma reorganização destes filamentos, conferindo à cél a forma arredondada que eu observei.
E o outro professor não entendia como eu ia ver a atividade do MXR com rodamina no FACS... tentava explicar o experimento, mas eles conversavam entre si. Pedi a palavra, expliquei o experimento (q eu já estava acostumada zilhões de vezes) e quando falei do verapamil (inibidor do MXR) ele para a professora: “mas verapamil não é inibidor de canais de Ca?” E eles falaram que o esquema do desenho experimental ficou confuso.
E eles achavam que uma das perguntas que eu responderia era de que modo o Cd pode afetar o citoesqueleto.
Fiasco total. Acho que não foi dessa vez. Mas não tem problema, junho estamos aí.

Palavras sensatas em momentos equivocados. O que é ruim pode ficar pior.

E depois da entrevista fui correndo comer o ensopadinho da dindinha.

PS.: Sei que a finalidade desse blog é científico, mas gostaria de compartilhar este momento pois sei que aqueles que o leem são muito amigos e queridos, por isso peço um favor: que fique entre nós. Ainda não digeri a situação muito bem, ok? Para os colegas, continuo com a resposta padrão para a pergunta como foi na entrevista: “foi bem, foi bem, agora é só esperar o resultado”.