Em que ponto estamos?

Este post é para situar a que pernas andam meus experimentos no mestrado. Seguem:

1) Pgp: ainda preciso procurar e testar um protocolo que eu consiga des-aderir as células para passar pelo citômetro, mas sem usar EDTA (o EDTA previne a agregação das células, impedindo que elas se grudem como uma bola gigante). Além disso, eu poderia fazer um ensaio rápido para observar se tem (ou não) Pgp nos hemócitos, já que tenho tudo que preciso: já sei como encaixa as lentes do microscópio de fluorescência, e os reagentes - rodamina 123 e verapamil já chegaram (o modelo do experimento está neste post);

2) extração de metalotioneínas: já tenho 10 glândulas digestivas congeladas no freezer -80 graus (agora funcionando direitinho) para testar o protocolo. Os reagentes já chegaram e as soluções necessárias já estão prontas. Já peguei as pastilhas dos inibidores de proteases para testar também e ver se dá pra quelar os metais (ou seja, mantê-los indisponíveis para as proteínas que tem afinidade por metais) da glândula. A partir daí dá pra continuar o protocolo de purificação da metalotioneína para ir para o sequenciamento de proteínas;

3) Experimento da exposição das ostras à cádmio: ainda não comprei a peça que preciso para conectas as duas mangueiras de calibre diferentes. Preciso marcar pra ontem pra fazer este experimento razoavelmente grande, mas não consegui ainda encontrar um período "calmo" - sem disciplinas ou congressos.

4) Bradford: achei no site da sigma um texto explicando como fazer o ensaio, e com informações importantes. também achei no periódico "Current protocols in protein science" um artigo falando de vários métodos colorimétricos, inclusive o Bradford. Já li e estou relendo com mais calma. Também preciso checar os componentes do tampão em que vou manter a proteína, pois a curva padrão teria que ser feita neste mesmo tampão, e alguns componentes possuem limite máximo de concentração para que não ocorra interferências na dosagem.

Mas isso tudo não é prioridade, mas sim fazer o gradiente de percoll (um método para separar as células ) e repetir alguns experimentos de citoquímica, para assim ressubmetermos a short communication.

Sacode a poeira...

Após comer uma banana split com os amigos do curso de francês, finalmente criei coragem para sair da acomodação e retomar o blog. Depois do encontro de Weblogs (falarei dele com mais calma no próximo post) fiquei empolgadíssima em retomar e até reformular o blog, mas dei um tempo até para refletir em qual ou quais mudanças poderia fazer. a sacudidela da Ju em um comentário do post sobre Pgp também me fizeram acordar. Só que, além de todo o tipo de exercício e treinamento que escrever no blog pode me proporcionar, volto especialmente para dizer que FILOSOFIA É DEMAIS!!!!

Estou fazendo uma disciplina na pós-graduação chamada de 'filosofia da ciência'. Além de ser uma matéria fácil, com um bom número de horas, não ter lista de presença e a prova é escrever a sua opinião e sugestões para a disciplina (ou seja, tudo o que um aluno consideraria uma disciplina dos sonhos) as discussões estão sendo ótimas e superprodutivas. Já fiz disciplinas deste estilo, de discussão em todas as aulas, e se a turma não for boa, ou se o professor não souber conduzir os debates, chega num ponto que chamamos de looping: repetições e mais repetições das mesmas coisas antes já ditas anteriormente. Este é o exato momento em que o professor deve instigar novos questionamentos, mudar de assunto ou até mesmo encerrar a aula. Senão a aula fica chatérrima, com uns poucos alunos discutindo. E as aulas estão sendo conduzidas muito bem neste sentido: claro que vira e mexe alguém dá uma guinada de 360 graus para parar no mesmo lugar, mas nada muito traumático.

Filosofia da ciência. Ciência da filosofia. Estas duas áreas são muito distintas, diferentes? são iguais? São faces da mesma moeda? São irmãos gêmeos? Univitelinos ou bivitelinos? Quem são os cientistas e os filósofos de hoje? E os de 300 anos atrás? Eis perguntas e ideias levantadas e debatidas na primeira aula.
À primeira vista, creio que todo mundo deve responder que são coisas totalmente diferentes. Filósofo é o cara que fica sentado em algum lugar pensando sobre assuntos existenciais, como se há um Deus, de onde viemos, para onde vamos, o que são o amor, a bondade, a virtude etc etc. O cientista é o cara que trabalha no laboratório, que sempre procura respostas para tudo... epa! Resposta? Mas o filósofo também procura respostas... para perguntas diferentes, talvez. Mas o cientista também pensa (e como!). O que fazer, como fazer, se deu certo, se não deu, por que que isso ou aquilo aconteceu de tal maneira...
Lá pelos anos de ouro da Idade Média, que apesar de ser conhecida também como idade das trevas ela possuiu muitos acontecimentos intelectuais, quem tratava destas questões de ciência, filosofia, matemática, geometria, astronomia, astrologia, alquimia, política, etc. eram as mesmas pessoas! Nao havia SÓ o filósofo, ou SÓ o cientista, mas um cara genial que sacava praticamente de tudo! Esta separação em duas "disciplinas" distintas foi ocorrendo ao longo dos anos, tornando talvez estas irmãs praticamente sem conexão, mas há muita filosofia na ciência, e muita ciência na filosofia!

Não existe Pgp?!

Estava relembrando como as células irão (espero eu) se comportar nos experimentos para verificar a atividade de uma proteína que “expulsa” diversas substâncias potencialmente nocivas à célula: a glicoproteína P (cuja abreviação é Pgp). Basicamente, o experimento funciona na seguinte maneira: em uma cultura de células, você adiciona um determinado corante fluorescente (no caso a rodamina B)Se essas células possuírem a Pgp, essa proteína vai “expulsar” o corante do interior da célula e ela pouco fluoresce (para fluorescência, é possível conferir se a célula fluoresce observando-as no microscópio; para quantificar a fluorescência, as células são “lidas” por um aparelho próprio, o citômetro de fluxo). Se é adicionado um inibidor dessa proteína, esta pára de “expulsar” o corante de dentro da célula, que passa a apresentar alta fluorescência (observe o esquema que fiz, abaixo).

Esquema simplificado do funcionamento da Pgp ao adicionarmos o corante Rodamina B

Este ensaio também serve para deduzir se uma determinada substância é ou não expulsa da célula pela Pgp. Se adicionarmos algum poluente, por exemplo o cádmio (sempre puxando sardinha para meu lado rs) e a fluorescência for baixa, significa que o cádmio não é expulso pela Pgp, já que ela estará expulsando o corante. Já se a fluorescência for alta, há duas explicações: 1) o cádmio um substrato para a Pgp (ou seja, a proteína vai expulsar menos corante para também expulsar o cádmio) ou 2)o cádmio é um inibidor da PGP (a proteína expulsa nenhum dos dois compostos)

Bom, e eu preocupada relembrando esses detalhes para analisar os resultados. E ainda nem estabeleci um protocolo de experimentos. Após conseguir manter as células “separadas”, isto é, sem formar agregados usando uma solução anti-agregante, o Rapha me aconselhou a não usar esse tipo de solução quando fizer os ensaios para Pgp, especialmente por conter EDTA, uma substância que torna indisponível cálcio e magnésio para a célula (muito importantes em diversas reações celulares). Eu tinha 2 opções:

1) fazer o ensaio com as células aderidas na placa. Complicação: o uso de tripsina pode danificar seriamente as células.
2) Fazer o ensaio com as células em suspensão. Complicação: como eu não poderia usar o anti-agregante, as células agregariam absurdamente. Além disso, teria que fazer mais centrifugações para retirar e lavar o corante, o que aumentaria mais ainda a agregação.

Procurando na literatura protocolos deste experimento, descubro que a grande maioria (22 de 24 trabalhos listados na base de dados pubmed) utilizam tecidos como brânquia e glândula, e não hemócitos. Apenas 2 trabalhos abordavam hemócitos. Mas em vez de ajudar, fiquei preocupada, especialmente o de Sversson (2003), que não encontrou atividade da Pgp em hemócitos do mexilhão Mytilus edulis, apesar de outro autor (Minier, 1996) ter encontrado uma proteína com mesmo peso molecular de Pgp e reação positiva para um anticorpo anti-Pgp de humano. (Thiago, isto te lembra algo?!)

Fica a pergunta para ser respondida daqui a alguns dias: será que há atividade de pgp nos hemócitos que eu estudo?

Quando a união não faz a força

Trabalhar com células possui seus percalços, que variam de acordo com cada tipo celular. Os hemócitos não fogem à regra. A Paulinha trabalha com hemócitos de caranguejo, e eu com hemócitos de ostra. E compartilhamos um mesmo problema: a agregação (ou coagulação) destas células. Logo que fazemos a punção dos hemócitos, eles se unem em uma maçaroca de células, com a qual não é possível fazer nada. Um grande empecilho. A Paulinha sofre mais que eu: "meus" hemócitos agregam bem menos que os "dela".
Semana passada passei as células no citômetro de fluxo para tentar identificar as populações de hemócitos, necessária para seguir com meus experimentos. Mas a agregação dos hemócitos foi um problema sério. Isso acontece principalmente porque preciso fazer uma centrifugação a fim de concentrar as células e ressuspendi em um meio de cultura, o L-15.
Resultado. Agregou geral.
Em seguida, testei ressuspender as células em uma solução bem conhecida pelo pessoal que trabalha com hemócitos: o antiagregante,que, como o nome diz, impede a agregação. Bingo! células livres, leves e soltas. Resultado. no citômetro, a identificação das células ficou bem melhor.

Artigos russos

No filme “bonecas Russas”, Xavier reflete que sua vida amorosa se assemelha àquelas bonequinhas típicas da Rússia, as Matrioshkas, onde dentro de cada boneca existe uma menor. A busca de informações nos artigos também segue a lógica da bonecas russas: você acha um artigo com alguma informação do seu interesse, mas este cita outro artigo. Você busca a segunda citação, e este cita um terceiro. E quando você acha que o terceiro é o último...bem, pode existir um quarto, ou não nenhum. Mas o pior é quando a informação que você tanto procurava não está em nenhum daqueles que você procurou.

Eu queria comparar como Cao (2003) preparou uma cultura primária de hemócitos de Mytilus galloprovinciallis. Começou nos materiais e métodos com a indicação “segundo Barcia et al. 1999” e fez uma descrição rápida dos procedimentos. Segui esta referência, que me levou ao Hughes et al. (1990) que citava mais um autor cujo trabalho não encontrei nos sites de busca. Em Barcia e Hughes, estava descrito exatamente a mesma preparação que em Cao. Não havia as informações que eu buscava:se as células eram centrifugadas, qual a velocidade e em qual solução seriam ressuspendidas. Em Barcia, há uma centrifugação de 3000 x g com ressuspensão em um tampão para lisar as células. Portanto, esta centrifugação não era para manter as células vivas.

Mas voltando o que me interessou no artigo de Cao. Manter cultura primária de hemócitos (ou melhor, invertebrados como um todo) é muito difícil, principalmente porque não se sabe exatamente quais nutrientes estas células necessitam para sobreviver. Neste artigo, ele consegue manter as células vivas (em torno de 100%), por cerca de 20 dias, o que é um tempo muito bom.

Fig. 1: gráfico de sobrevivência de hemócitos em fungicida (bolinha = 1ug/mL; triângulo: 0,5ug/mL; quadrado: 0,1ug/mL) e em soro fetal bovino (A) e hemolinfa (B)

Neste gráfico, ele analisou o efeito de um fungicida em 3 concentrações diferentes de um fungicida e de duas substâncias que melhoriam a cultura de células: (A) soro fetal bovino – muito usado em culturas de vertebrados por conter diversos componentes (como vitaminas, proteínas, carboidratos, etc) necessários para a sobrevivência das células – e (B) hemolinfa inativada (é como se fizesse um análogo do soro fetal bovino: a hemolinfa foi aquecida, centrifugada e filtrada).
Das três concentrações, a menor concentração do fungicida (0,1µg/mL) apresentou melhor resultado. Com 100% das células viáveis por 20 dias em presença de soro. Quando adicionada a hemolinfa, e esse valor subiu para 25 dias. O curioso é que a concentração de 10 µg/mL é muito comum em culturas de vertebrados, e causa morte de 50% das células após 5 dias de cultura. Por isso que, se trabalhando com invertebrados, sempre temos que adaptar nosso protocolo.
Nas minhas culturas de hemócitos, eu uso uma concentração de 10 µL/mL do antibiótico penicilina-estreptomicina e não utilizo soro nem hemolinfa para complementar o meio de cultura. E olha que esta concentração já foi mais alta, de 100 µL/mL, mas diminuí após sugestão de conversar com uma menina que apresentava trabalho em um congresso que fui.
Tudo bem, as células estão vivas. Mas será que estão saudáveis? Para mim que trabalho com ensaios de toxicologia, até que ponto determinado efeito é causado por um poluente e não pelo fato de as células estarem débeis (doentes)? Por isso que existem diversos ensaios para conferir a “saúde” das células, como a fagocitose, uso de diversos corantes (como o meu vermelho neutro) entre outros. No artigo, ele utilizou como ensaio a quantificação de uma proteína que é envolvida na fagocitose. Então, ele determinou que 3 dias de cultura seria o ideal para fazer este ensaio. Trocando em miúdos: às vezes, não é de grande valor manter a cultura por longos períodos, se o ensaio, teste, however, o seu objetivo não é eficiente em culturas longas.

Poli-lisina e aderência celular

AS células sempre procuram um substrato para aderir, não costumando ficar em suspensão em uma solução. Este substrato pode ser placas de petri, lâminas, lamínulas... Aliás, a desaderência pode ser até indício de que a célula está entrando em morte celular programada, também conhecida como apoptose.

E alguns tipos celulares são danados para não aderir. Ou melhor, elas ficam aderidas por um (pouco) tempo, de algumas horas, mas se é preciso fazer experimentos com exposição de drogas por períodos muito longos, algo como 24h, 48h, 72h com o passar do tempo o número de células aderidas pode diminuir substancialmente.

Para melhorar esta adesão, existem substâncias que são muito empregadas nos laboratórios, como colágeno e laminina, que são proteínas de matriz extracelular (é o material que fica em volta das células, que mantêm a aderência entre as células, formando tecidos, além de outras funções). Elas em geral atuam por atrações de carga: como o lado externo da célula possui carga líquida positiva, estes compostos possuem carga negativa. Inclusive li um trabalho que comparava qual seria a melhor substância para melhorar a adeão celular. E a campeã foi a poli-D-lisina.

A polilisina é um polímero (por isso o prefixo poli) feito do aminóacido lisina. Em outras palavras, é uma lisina "amarrada" na outra. Se a o grupo carboxila do aminoácido lisina "estiver" (na verdade este conceito é muito complexo para explicar am poucas linhas) na esquerda, teremos a poli-L-lisina. E se "estiver" na direita, teremos poli-D-lisina. Sendo que, na natureza, só encontramos proteínas formadas com aminoácidos na forma L.

Sempre usei poli-L-lisina para melhorar a aderência das minhas células, o que de fato ocorre. Porém lendo um artigo que a Ju me enviou, os autores usaram a versão D, sendo que em todos os artigos já lidos por mim a forma usada era a L. Mais tarde, pesquisando no site da Sigma-Aldrich, uma empresa que vende produtos para laoratório, estava escrito na seção FAQ a diferença: como a forma L é encontrada na natureza, alguns tipos celulares podem digeri-la, através de proteases. Nestes casos, a forma D seria a mais recomendada.

Então veio a pergunta: será que meus hemócitos estariam digerindo a poli-L-lisina? Será que eles secretam proteases? Sim, é possível, já que são células circulantes na hemolinfa, e responsáveis pelas respostas de defesa contra patógenos. Mas para não ficar no "achismo", busquei artigos que tivessem feito algum tipo de reação para proteases. Achei um trabalho que fazia detecção de diversas enzimas, entre elas...proteases.

Outro detalhe: buscando mais informações sobre polilisinas, vejo uma pergunta sobre a poli-L-lisina que uso:

- "A polilisina P8920 (nº do catálogo) pode ser usada para cultura de células?"

- "NÃO (grifo meu), pois ela contém 0,01% de timerosal, que é um conservante. Este produto é indicado para aderência de tecidos em lâminas. Para culturas de células, deve ser usado o produto PXXXX que é similar mas sem o conservante".

Ainda, mas ainda bem que não consegui encomendar a poli-L-lisina...

Happy!!!!

Primeiramente:
Passeeeeeeei no mestrado! Agora serei uma pós-graduanda !!! (só falta fazer a matrícula)

Segundo, este post é para tentar clarear algo que está tirando meu sono há algum tempo: os granulócitos da ostra que trabalho, Crassostrea rhizophorae.
A única caracterização morfológica dos hemócitos foi feito por Tânia Barth sob orientação da Marguerita Barracco, a quem tive o prazer de conhecer e traballhar em seu lab por alguns dias.
Ela fez a microscopia óptica dos hemócitos, corando com o corante Giemsa. Nela, ela achou três tipos de hemócitos: um sem grânulos, (hialino), com pouco citoplasma e núcleo grande. Outro hialino mas com muito citoplasma e núcleo menor. E o granulócito, que contêm grânulos no citoplasma. Só que o que vejo nas minhas células é um granulócito com grânulos bem maiores que os dela. Mas ao procurar imagens dos meus granulócitos, achei céls com grânulos parecidos (veja as fotos abaixo):

Hemócitos de C. rhizophorae. a: granulócito da Barracco; b: granulócito semelhante ao da Barracco e c:granulócito diferente ao da Barracco.

Sobre os hemócitos da figura c, pensei em duas hipóteses:

1) que, na verdade, são células de parasitas (protozoários, amebas, etc);
2) são células do músculo, e não da hemolinfa;

Mas ao ler um artigo que o João me enviou, lá de um pessoal da França, vi que na população de hemócitos pode aumentar a porcentagem de granulócitos. Apesar de ele estar se referindo a experimentos com exposições de xenobióticos em culturas in vitro (provavelmente esse aumento ocorreu devido à morte de hialinócitos), isto me deu uma luz. Os granulócitos podem aumentar de freqüência na hemolinfa! Inclusive eu já vi trabalhos que fizeram contagem diferencial em diferentes estações do ano para quantificar possíveis mudanças. Então pensei em mais uma hipótese:

3) manter as ostras no aquário faz que a população de granulócitos aumente além de mudar a morfologia dos grânulos, fazendo com que fique maiores.

Eu penso que esta seja a mais coente porque: i) não observava este tipo celular logo assim que as ostras chegavam; ii) a Barracco mantinhas as ostras no aquário por no máximo 48h.

Vou buscar artigos que falem sobre estas alterações dos hemócitos em bivalves que estejam sob condições de laboratório em outras espécies, além de verificar isto na próxima chegada de ostras. Aliás, manter este aquário descente está difícil, mas vou conseguir!