Toda profissão tem seus vieses. Mas também suas alegrias. E não falo somente de ir a congressos, visitar labs fora da UFRJ (ou até mesmo dentro), fazer churrasco (ou ir à CADEG!!!!) no fim do ano.
Desde que entrei no estágio no radioiso venho tentando fazer uma cultura primária dos hemócitos. Procurei protocolos, testei, adaptei, e nada. Me perguntava (e até hoje me pergunto) "como eles fizeram para conseguir x% de céls viáveis?!" Mas eu não me dei por vencida.
Desconfiada que a centrifugação estivesse estressando demais as células (sem falar que são 10 min de centrifugação, depois ressuspende, etc), tirei hemolinfa (hl) e plaqueei direto. Sem centrifugar. Sem anti-coagulante. Pá-pum, simples assim. Geladeira (isso é assunto pra mais tarde). 24h depois e voilà! céls aderidas! céls não coradas de Trypan! Eu! Eu!Eu! Eu que fiz!!!
E essa semana, mais uma alegria ao sabor "eu que fiz" (made by Americo&Figueiredo). A ju não tava conseguindo extrair RNA da hl de jeito nenhum. Brânquia e Gl. digestiva, blz, tudo bonitinho. Já na hl...as razões lá que tem q dar no nanodrop tudo ruim, a quantidade era muuuito pouquinha... por ex, a razão RNA/ptn tem q tá em torno de 2 - o q significa que tem nenhuma ptn, pois o processo de extração separa o RNA do resto (ptn, carboidrato, lipídio). se tiver baixa, é pq tinha mt proteína. Tava dando 2,8 (o q significa? mt pouco RNA e mt ptn?)
E pensando, e pesquisando, sugeri: "centrifuga". Acho que fizemos isso 1 tempo atrás, com 1 ostra só. Desta vez tirei hl d umas 4 ostras, que deu no total 9 mL. Pellet buniiiiiiiiiiiito!!!! Faz o protocolo, tal tal... voilà!!!! melhorou!!!! RNA em excelentíssima quantidade, razão RNA/ptn ok...
mas nem td tava perfeito... a razão das absorbâncias 260/230 nm deu abaixo do ideal, o q siginifica que pode ter sido contaminação por trizol, etanol polissacarídeos, outros compostos compostos orgânicos, mts outras coisas. Então ela fez umas modificações no protocolo pra ver se dar pra melhorar essa razão. Mas mesmo que não der, fico feliz por já termos conseguido modificar as outras 2 variáveis q ñ estavam dando certo.
Mas o resultado só saberemos na segunda. sabe como é repartição pública, ponto facultativo...
Desde que entrei no estágio no radioiso venho tentando fazer uma cultura primária dos hemócitos. Procurei protocolos, testei, adaptei, e nada. Me perguntava (e até hoje me pergunto) "como eles fizeram para conseguir x% de céls viáveis?!" Mas eu não me dei por vencida.
Desconfiada que a centrifugação estivesse estressando demais as células (sem falar que são 10 min de centrifugação, depois ressuspende, etc), tirei hemolinfa (hl) e plaqueei direto. Sem centrifugar. Sem anti-coagulante. Pá-pum, simples assim. Geladeira (isso é assunto pra mais tarde). 24h depois e voilà! céls aderidas! céls não coradas de Trypan! Eu! Eu!Eu! Eu que fiz!!!
E essa semana, mais uma alegria ao sabor "eu que fiz" (made by Americo&Figueiredo). A ju não tava conseguindo extrair RNA da hl de jeito nenhum. Brânquia e Gl. digestiva, blz, tudo bonitinho. Já na hl...as razões lá que tem q dar no nanodrop tudo ruim, a quantidade era muuuito pouquinha... por ex, a razão RNA/ptn tem q tá em torno de 2 - o q significa que tem nenhuma ptn, pois o processo de extração separa o RNA do resto (ptn, carboidrato, lipídio). se tiver baixa, é pq tinha mt proteína. Tava dando 2,8 (o q significa? mt pouco RNA e mt ptn?)
E pensando, e pesquisando, sugeri: "centrifuga". Acho que fizemos isso 1 tempo atrás, com 1 ostra só. Desta vez tirei hl d umas 4 ostras, que deu no total 9 mL. Pellet buniiiiiiiiiiiito!!!! Faz o protocolo, tal tal... voilà!!!! melhorou!!!! RNA em excelentíssima quantidade, razão RNA/ptn ok...
mas nem td tava perfeito... a razão das absorbâncias 260/230 nm deu abaixo do ideal, o q siginifica que pode ter sido contaminação por trizol, etanol polissacarídeos, outros compostos compostos orgânicos, mts outras coisas. Então ela fez umas modificações no protocolo pra ver se dar pra melhorar essa razão. Mas mesmo que não der, fico feliz por já termos conseguido modificar as outras 2 variáveis q ñ estavam dando certo.
Mas o resultado só saberemos na segunda. sabe como é repartição pública, ponto facultativo...
2 comentários:
Isso aí. Quando as coisas não funcionam repetidamente, o jeito é colocar a cabeça para pensar no porquê...ou buscar uma luz no pubmed :)
Obrigada pela ajuda com a hemolinfa (pellet ficou bonitinho mesmo). Acho que as ostras não vão com a minha cara, pois só dão o "sangue" para você hehehe
Bjs
ah, depois de 2 anos, tinha que conseguir domesticá-las!
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