sexta-feira, 26 de dezembro de 2008

Quem Descobriu? - O DNA como transmissor da hereditariedade

Nós aprendemos na escola que o responsável pela transmissão da informação genética é a molécula de DNA. Aliás, no CAp (Colégio da Aplicação da UFRJ), a minha “aula inaugural”, chamada de regência, foi sobre mitose e englobou também alguns conceitos envolvendo o DNA: cromossomos, cromátides, compactação do DNA, etc. A aula foi sobre como a célula se divide em duas, e como a sua célula-filha continua tendo o mesmo material genético e em igual quantidade que a célula-mãe. Mas isto será tema de outro post.

Voltando à transmissão da informação genética: é provável que algum aluno mais curioso tenha se perguntado: “mas como eles descobriram que era o DNA?”. Muito simples: fazendo experimentos.
Quem deu o pontapé inicial foi Frederick Griffith, nos anos de 1928 (Detalhe: O DNA já havia sido descoberto nessa época, só a sua estrutura molecular que foi elucidada por Watson e Crick. Pelo amooor de Deus, não foram eles que descobriram o DNA!!!). Ele trabalhava com dois tipos de uma bactéria pneumococus: uma encapsulada que causava infecção em ratos (portanto, era patogênica) e outra não encapsulada, que não causava infecção em ratos. (PS.: Algumas bactérias possuem uma cápsula em torno da sua parede celular). Ele identificava as colônias das bactérias a partir do aspecto das colônias: às não patogênicas chamou de R (do inglês rough, que significa rugoso) e às patogênicas, de S (do inglês smooth, que significa liso). Para facilitar a leitura do texto, vou criar uma legenda: Bactérias R são ñPat. (não patogênicas) e bactérias S são Pat. (patogênicas).

Esse é o F. Griffith

A partir disso, ele fez alguns experimentos. Injetou as bactérias S (Pat.) vivas em camundongos. Como era esperado, os ratos morreram. Em seguida fez o mesmo utilizando as bactérias R (ñPat.) e os ratos sobreviveram. Um terceiro experimento foi injetar as bactérias R (ñPat.) mortas pelo calor. Será que os ratos sobreviveram? Sim, sobreviveram, afinal as bactérias patogênicas foram mortas pelo calor. Então Griffith pegou os “restos” das baterias S (Pat.) mortas pelo calor e misturou com bactérias R (ñPat.) vivas e injetou esta mistura nos ratos. Aposto um doce como os ratos sobreviveram, alguém diria... mas não, os ratos NÃO sobreviveram. Para ter certeza dos resultados, Griffith repetiu várias vezes este mesmo experimento para ter certeza que tudo estava certo. Então ele verificou amostras de sangue dos ratos mortos no último experimento e encontrou as bactérias S (PATOGÊNICAS) vivas. Como foi possível, se antes ele havia injetado as bactérias S mortas pelo calor e os ratos sobreviveram? Havia alguma substância que transformou as bactérias do tipo R no tipo S.
E os responsáveis por desvendar este mistério foram 3 pesquisadores: Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn MacCarty. O ano: 1944. Eles usaram as mesmas bactérias, só que em vez de injetar em ratos, eles faziam culturas delas em placas de Petri, além de trabalhar com extratos celulares destas bactérias (o extrato celular é o líquido que se obtém após romper as células, contendo todas as substâncias presentes). Eles meio que “repetiram” os experimentos de Griffith. Primeiramente, fizeram uma cultura das bactérias R (ñPat.). Em seguida, rompeu as bactérias S (Pat.), ou seja, fez um extrato celular, e adicionou em uma cultura para células. Como era de se esperar, não cresceu nada. Agora eles pegaram as bactérias R (ñPat.), misturaram com extrato celular das bactérias S (Pat.) e preparou a cultura. E as células que cresceram foram...as do tipo S (PATOGÊNICAS)! Viu como foi repeteco do experimento do Griffith? Agora vem a novidade: eles queriam descobrir qual molécula era responsável pela transformação da bactéria R em S. Então eles prepararam o seguinte experimento: misturaram às bactérias R (ñPat.) vivas o extrato da S adicionado de: 1)enzima protease (que degrada proteínas); 2) DNAse (que degrada o DNA) e 3) RNAse (que degrada o RNA). A idéia era a seguinte: se a proteína fosse responsável pela transformação da bactéria, se adicionarmos algo que destrua/acabe/inative com a proteína a bactéria não vai se transformar. Este raciocínio serve também para o DNA e RNA. E então, qual cultura não cresceu bactéria, a de nº 1, nº2 ou nº 3? Respostas no “meus comentários” deste blog, por favor... e com justificativa!
Este é o Oswald Avery

terça-feira, 11 de novembro de 2008

Fim de ano, arrumando a casa

É comum a gente tirar o fim de ano para arrumações: arrumar o(s) armário(s), o quarto, se livrar do material acumulado ao longo do semestre/ano para dar espaço a mais material, se livrar de dívidas, enfim, arrumar a casa. E aqui no laboratório não é diferente. Vai chegando fim de período (provas, trabalhos, provas, relatórios, estuda, estuda, e mais provas), que já é uma correria, quando é fim de ano então, nem se fala. Somando a isto fim de graduação (monografias, relatórios, documentos, colação de grau, nada consta, formatura, etc, ou seja, meu caso) parece que 24 horas é nada. Graças a Deus que a prova do mestrado foi adiada para fevereiro, se não estaria realmente enlouquecendo.

Como ia falando, fim de ano não deixa de ser fim de ano no laboratório. Os experimentos vão ficando escassos. E também é época de avaliar a produtividade do ano, analisar resultados, pensar em novos projetos, sair em busca de novos financiamentos...e arrumar o laboratório. Fazer uma lista de tudo que falta e o que precisa ser organizado, para começar o ano tinindo de novo, sim senhor!

Já que a Ju ia (ou melhor, foi) para a Itália domingo último, combinamos de fazer as duas coisas que o laboratório precisava com urgência: descongelar a geladeira e o freezer, que estavam afogados em gelo. Secadores de cabelo e faquinhas e colheres a postos, partimos para a empreitada, com muita música, é claro, na última semana. Aproveitamos também para jogar muitas coisas fora, reorganizar outras para os armários, organizar a bancada do gel...
"Seu Freezer" descongelado, pronto para o verão


Juliana com a mão na massa!

Agora que estou só (a Giselle como está passando por todo o processo de fim de ano descrito no 1o parágrafo, pouco aparece), estou me dedicando a pequenas miudezas do lab. Comprei um pendurador de roupas, para pendurar nossos jalecos, que ficavam jogados sobre o "frigobar"; comprei uma caixa grande (daquelas de plástico para guardar brinquedos, por exemplo) para fazer um banho e deixar a vidraria de molho em Extran (um tipo de tetergente mais forte que o Limpol) e uma menorzinha para fazer o banho do ácido nítrico e deixar a vidraria contaminada com metais pesados de molho.

O próximo passo é comprar um filtro externo para aquários, e transferí-lo do lab onde ele está para cá, na 32. Lá no outro a temperatura varia muuuito, há dias que vou pegar ostras para experimentos e a água está morna. E ter estes fatores físico-químicos (pH, temperatura, salinidade...) variando muito não é legal para experimentos.

Promessa de fim de ano: procurar uma assistência técnica para limpeza do ar condicionado. Não faço i-déi-a de como limpa um Springer (aquele ar-condicionado que é compridinho). Os que temos é fácil, spo tirar a telinha e lavar. Mas esse...todo cuidado é pouco, pois sem ele é impossível ficar no lab (subsolo +tamanho diminuto + verão do RJ, imaginou?).

Com certeza há outras miudezas para ajustar, mas aos pouquinhos chegamos lá.

sábado, 16 de agosto de 2008

Mais um erro que vira acerto

Quinta feira a Ingrid ia contar uma placa - desta vez usando o L15 com HEPES e no dia seguinte, Só que quando cheguei no lab, voltando do CAp, vi que ela tinha esquecido de retirar o VN e adicionar o L-15 para só depois contar. Tudo bem, falhas acontecem, e ainda perguntei se ela conseguiu contar com o VN lá. E sim, é possível contar com o VN no poço! Eu tirava porque no início dos meus experimentos com este corante percebia que as céls estavam ficando ruins por causa do corante, mas agora relembrando com meus botões percebo que as céls já não estavam muito boas. Agora está resolvido uma das diferenças do meu protocolo de VN para o do Moore e cia.

sexta-feira, 8 de agosto de 2008

Como montar um experimento???

Dúvidas ó dúvidas...

Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.
Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.

Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!


Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?


Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.

E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...


Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)
Quantas dúvidas, quantas idéias...

domingo, 3 de agosto de 2008

Aventuras em Angra dos Reis


Na sexta última (1), fomos eu e Ju para Angra enfrentar os coquilles (Nodipecten nososus, família Pectinidade). Eu, especialista em puncionar hemolinfa do músculo, fui junto para fazer o trabalho e ajudar a Ju no mestrado dela. E ela retirou as brânquias, glândula digestiva e músculo (e que músculo!)

Depois de 2h e meia na kombi barulhenta e sacolejante, após diversas retenções por conta das obras de duplicação de pista e reforma dos 2 túneis que vão para a costa verde, chegamos ao projeto POMAR, onde a Petrobrás instalou um centro de cultivo de sementes (bivalves jovens). O dia estava lindo e tínhamos a vista para o mar. Esperamos o Petrus achar o contado dele e, de cara com os coquiles, começamos nosso trabalho. Gastei uns dois coquiles para achar a posição correta de furar (não era tão difícil assim como pensei). O músculo do bicho é enorme, e bem forte, pensei que ia tirar litros de hemolinfa. Que engano... o máximo que consegui tirar foi 1 mL, e muitas vezes cheio de pedaços de tecido, que analisando depois eram ora pedaços do manto (parte mole do bicho que fica preso mais externamente à concha, na beiradinha) ora da brânquia, que rodeava um pouco o músculo e era de cor alaranjada. Mas a melhor (ou pior) parte foi "judiar" do bichinho. Eu distraída e o Petrus chamou a atenção de que o coquiles, mesmo depois de ter as valvas (cada metade da concha é chamada de valva) separadas, ele continuava contraindo o músculo como se fosse para fechar as valvas. Ao estimular o manto ou o próprio músculo, este se contraía e o manto também mexia! A Ju ficou morrendo de pena, repetiu diversas vezes que ela não ia para o céu, disse"tadinho!" umas cem vezes e eu, sádica, cutucando o bicho. Até que um parente dele se vingou com um golpe de mestre: gentilmente "se abriu" para eu espetar o músculo com a seringa e enquanto fazia força para puxar o êmbolo Plof! Ele dá uma contração com toda a força! Quase que meu dedo vai, quase que me espeto com a agulha. Xinguei o bicho, e como xinguei. Tive que apertar as duas valvas para que não ocorresse de novo.

Imagem do coquiles aberto. A parte branca na imagem é o músculo que fecha as valvas; a parte laranja são as brânquias.

Eu e a Ju abrimos mão do nosso almoço (o Petrus e o Carlos, que nos levou até lá almoçaram enquanto trabalhávamos) para voltarmos logo na sacolejante e barulhenta kombi, percorrendo as sinuosas pistas daquela região. Não me aguentei: dormi em cima da minha mochila e só acordei já na Av. Brasil. Pensava que a hemolinfa não tinha sido suficiente, que a Ju não conseguiria extrair quase nada de RNA... e qual não foi nossa surpresa, ao chegarmos no lab, que havia uma "maçaroca" branca decantada no falcon! Isto muito provável é sinal de hemócitos, e a Ju havia me falado antes que aconteceu o mesmo com os hemócitos das ascídias da Cíntia, de tanta célula que havia.

Como já estávamos enjoadas de carro, era sexta feira e nem brincando queríamos pegar a Av. Brasil, fomos embora de barca. Melhor balançar de outro jeito...

Ah, mais algumas informações sobre o projeto e o coquilles, clique aqui.

sábado, 26 de julho de 2008

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 5

Finalmente o último dia.
A aula de manhã foi com o Rubem, o coordenador do nosso grupo de seminário. Figuraça. Ele falou de morte celular: apoptose, autofagia e autólise. Muito bom e muito importante pois é um tema que pode cair na prova do mestrado (rs). Ele terminou a aula mais cedo para que pudéssemos nos preparar para o seminário, pois os outros membros do meu grupo tiveram problemas para preparar as partes deles. A Tati, coitada, depois de ter virado a noite preparando a apresentação, ao mesmo tempo que em fazia outras dezenas de coisas, quase surtou quando às 5 da manhã, já com a apresentação pronta, o pc resolveu corromper o arquivo... enfim, ossos do ofício de depender do pc.

Tiramos foto no Castelo - símbolo da Fiocruz - junto com o grupo do curso de biotecnologia. Almocei um queijo quente e partimos para o seminário.

O meu grupo foi o segundo. E de fato fiquei nervosa ao ver que nao era só apresentar o seminário e pronto, ninguém faz perguntas, ou poucas perguntas. Nada. Cada um - Rubem, Moema, Alessandrae Mariana - disse conseiderações. Uma apresentação "tese-like". Eu que fui de vestido, até tirei o casaco na hora da minha parte, pois o calor do nervosismo me tomou rs.

Mas no fim de tudo - e já com o certificado na mão - gostei de ter sido assim. Falei para Moema que foi a primeira vez que me senti na frente de uma banca, mas sem a parte ruim (ter o conceito do trabalho). Todas as colocações foram ótimas (e como o Rubem é chato! rs quero ele na minha banca rs) e estão devidamente anotadas no bloquinho...ah, aquele bloquinho vale ouro!

E mesmo cansada, topei ir ao cinema no Bay Market com a Tati e o Felipe (voltamos de carona com o pai do Felipe), pois merecíamos este agrado!

PS.: Para o leitor atento, que reparou que este post e o anterior tem a data de sábado: na quinta, osite do blogger simplesmente resolveu tirar folga e ontem cheguei cansada, e obviamente despenquei na cama.

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 4

Quinta-feira. Penúltimo dia.

Na parte da manhã tivemos aula com a Alessandra, sobre interação parasita-hospedeiro. Como estava muito cansada de ontem, me dei "ao luxo" de sair da cama um pouquinho mais tarde, até porque já sabia os horários que o Madureira (o ônibus que vai direto para lá e que passa a cada meia hora) passava e também não era um assunto que não me interessava taaanto. Ainda bem que cheguei a tempo de começar a aula, pois, além de a Alessandra dar aula maravilhosamente bem, o assunto foi muito interessante e ela disponibilizou diversos artigos sobre citoesqueleto e de imunologia (especialmente sobre vírus) que sempre são cobrados nos concursos da Fiocruz.

Mas o mais legal foi a técnica que ela mostrou para evidenciar citoesqueleto por...microscpia de varredura! Sim! com o uso de Triton, um detergente, a membrana citoplasmática é degradada e o que sobra é o cito... achei genial, algo que acho que vale a pena eu tentar nas minhas células...


À tarde tivemos microscópio confocal, para vermos nossas lâminas que montamos ontem. Nem preciso dizer que fiquei ba-ban-do com o brinquedinho. lógico que mal encostamos nele - só olhei as células e ajustei o foco. E o programa de imagem, tudo de bom...

Ainda bem que, por sorteio, fomos o primeiro grupo a ver as lâminas, o que significa que saímos mais cedo. O que não significa que cheguei em casa mais cedo, pois o Madureira demorou horrores, ficamos eu e a Tati esperando no ponto, a Av. Brasil parada... E chegar em casa também não significa descansar, pois amanhã é o último dia e o dia da apresentação do seminário. Medo! rs

quarta-feira, 23 de julho de 2008

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 3

Por motivos de força maior, não pude comparecer à parte da manhã, em que a Mariana deu aula sobre endocitose e tráfego de vesículas. Assim como as outras aulas, me disseram que também foi muito bom, mesmo não tendo sobrado uma gota de café no coffee-break (brincadeira, não é porque estava chata, mas neste coffee fizeram só uma garrafa de café, e não duas).

A parte da tarde foi marcada para começar 1:30, para terminar o experimento de ontem e dar termpo de observar no microscópio. Cheguei um pouco em cima da hora, e o meu almoço foi um Chicabon. :) Incubamos as células com faloidina conjugada com TRITC (que NÃO é um anticorpo, é uma droga que faz o papel do AC primário, ligando-se ao citoesqueleto e o TRITC é o fluorocromo), depois com DAPI, lavamos e montamos a lâmina. Quatro horas da tarde e a expectativa de observar se a reação funcionou após o lanchinho...mas...não deu pra ver nada. Não, não é que a reção não tenha dado certo, mas o microscópio de fluorescência não estava legal, a lâmpada tinha desalinhado e o Rubem não estava conseguindo realinhar. Ou seja, meu grupo nem os outros 2 puderam ver coisa nenhuma. Enfim, agora é esperar amanhã anciosamente para olhar as lâminas no...tcham tcham! No confocal!!! uhuuuuu

Agora vou-me pois tenho 2 artiguinhos e umas páginas do Alberts para ler par amanhã...e isso são agora 11 e meia da noite. Viu, isso que dá optar por uma esticadinha e ir ao teatro... :)

terça-feira, 22 de julho de 2008

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 2

Mais uma vez cheguei calma e tranquilamente na Fiocruz, por volta das 8:30. Dei uma volta em torno do Pavilhão onde o curso estava acontecendo, para explorar novas áreas e descobri uma lanchonete. Órimo, parei para tomar um café e comer um pão para começar o dia bem alimentada.


Hoje a manhã inteira foi com a Moema, sobre motilidade e divisão celular. Muito bom. A parte de divisão celular também foi muito proveitosa, prestei bastante atenção (principalmente porque é tema da minha regência no CAp). E o incrível que o papel do citoesqueleto não é somente na formação do fuso mitótico (que alinha os cromossomos no centro da célula, lembra? Não? Então olhe a foto abaixo), composto por microtúbulos.


O fuso mitótico está em verde: ele é composto por microtúbulos

A dinâmica dos microtúbulos é fascinante: polimeriza, despolimeria, proteínas motoras agindo como carrinhos sobre os microtúbulos, empurra organela pra lá, cromossomo pra cá... actina participando da citocinese, formando o anel que vai separar a célula em duas, associa-se à actinina, que também tem ajuda dos microtúbulos no processo...sem falar os videozinhos que a Moema selecionou, como este abaixo.

http://www.youtube.com/watch?v=CzPGhYiGyZ8



Parte da tarde, fomos ao laboratório fazer experimentos, cujos os resultados iremos apresentar em um seminário ao fim do curso. O meu grupo vai verificar a apoptose em células do timo. Para induzir a poptose, usamos uma droga - a dexametazona, velha conhecida das mamães por ser um composto de vários xaropes. As células já tinham sido incubadas a dexa- por 18h. Hoje fixamos as células, aderimos com poli-L-lisina (velha conhecida minha) e paramos por aí no protocolo pois já era 6 da noite.

A vantagem de as etapas serem longas (fixação,centrifugação, etc etc) é que...fazemos nada nesse meio tempo rs. Quer dizer, foi bom para nos conhecermos mais, interagir, bater papo, perguntar o que cada um faz, os planos de mestrado, e...histórias. Histórias de viagens a congressos, histórias de m... feitas no lab - afinal IC sempre faz m... e, o mais interessante: o Rubem me contou que seria uma opção correr atrás de patrocinadores como a Zeiss para tentar custear minha passagem para Bordeaux. E pensei, é claro, no meu grande amigo Marco Aurélio, que trabalha em uma empresa de materiais para laboratório e com quem praticamente compramos tudo. Será que o meu rostinho e a minha simpatia convencerão a chefia a me patrocinar? Veremos...

Ah, a resposta da pergunta do post anterior não esqueci. Só estou muito cansada, exausta mesmo, para responder hoje ;)

segunda-feira, 21 de julho de 2008

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 1

Sei que devo os processos da preparação que estou fazendo para microanálise de raios-X, mas os próximos posts serão sobre o curso de citoesqueleto que estou fazendo esta semana na Fiocruz. Este curso a Ju que me indicou, o Mauro e a Silvana acharam ótima idéia, e eu também. Exceto pelo fato de: ter que abrir mão da viagem de Pedologia (matéria compactada de férias, seria minha última eletiva!), ser justo na semana da liga mundial de vôlei (que eu queria ir a todos os 2 jogos do Brasil + semi-final e final, mesmo gastando uma pequena fortuna) e abrir mão de fazer uma barraquinha na festa junina da Biof, em parceria com a Ju, me divertir muito e quem sabe arrecadar uns trocadinhos para o o PRIMO15.
Bom, vamos lá. A Fiocruz é linda, grande, muito aconchegante, nem parece que fica encravada em um bairro onde o "bicho tá comendo", leia-se tiroteio confusão e morte, Manguinhos. Não ficava com medo, até descobrir que a "Faixa de Gaza" (R. Leopoldo Bulhões) fica atrás da Fiocruz. Para dizer a verdade, aquele lugar é outro mundo. (em breve fotos).

Jeito Lia de ser: sempre me perdendo. Achei que a sala fosse no IOC - onde fiz minha inscrição, mas na verdade era no pavilhão ao lado da biblioteca central. E voooolta a Lia tudo de novo, e quem conhece lá sabe que é longinho...mas a amanhã estava agradável, então nada como uma caminhada para acordar.
No pavilhão certo, o curso, marcado para as 9 da manhã, atrasou um pouquinho. Fizeram-se as apresentações, o material (camiseta, pasta, bloquinho, caneta com calendário e apostila) foi distribuído. A 1a parte foi com a Moema, sobre origem do citoesqueleto. Muito interessante, há proteínas semelhantes em procariotos que fazem "papel" de citoesqueleto, inclusive com conformações parecidas e origem evolutiva. Já a 2a parte, com a Alessandra, foi sobre a estrutura do citoesqueleto: ela abordou os 3 componentes do citoesqueleto, as moléculas que compõem cada filamento, proteínas acessórias, miogênese e miofibrilogênese (você sabe a diferença? Então me deixa um recado! Responderei nos próximos posts), importância de cada filamento do citoesqueleto. Foi um pouco corrido, pois estávamos com o tempo apertado, mas como a maioria das informações estavam na apostila, anotei só o necessário.



Componentes do citoesqueleto: microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários. À esq. imagens em MET.


À tarde, focamos nas técnicas de estudo das células - e como estudar citoesqueleto. Era a parte que mais me interessava. O Rubem é muito bom, e quando olhei no relógio já eram 15:40! (Começamos às 14:10h). Falamos desde microscopia óptica, um pouco do histórico, limite de resolução, objetivas, campo claro, contraste de fase, contraste de fase interferencial, confocal (finalmente entendi confocal!), MET, MEV, um pouco de criofratura e a novidade da M.E. de força atômica. Enfim, nesta parte tive a oportunidade de esclarecer todos as lacunas que eu tinha sobre técnicas (não fui muito feliz em bio geral, como muitos devem saber). E na 2a parte, a Mariana abordou os métodos utilizando imunofluorescência (mais uma vez muito esclarecedor): anticorpo(AC) primário, AC secundário, autofluorescência que o material pode emitir confundindo as análises (será que minhas céls tem isso?!), abordagens da marcação direta (a molécula que fluoresce, o fluorocromo, tá conjugada, quer dizer, ligada, ao AC primário) ou indireta (fluorocromo conjugado ao AC secundário), marcação com drogas (é o que faremos nas aulas práticas) e marcação por GFP.



Marcação por fluorescência. Em vermelho: actina; em verde: microtúbulos; em azul: núcleo

Este primeiro dia foi ótimo, muito bom, me ajudou a entender muita coisa que me confundia, que sabia só uns"pedacinhos", agora ganhei mais peças para completar o quebra-cabeça rs. Tá bom, ok, vamos lá, fiquei boquiaberta, não pensei que seria tão legal o citoesqueleto, em especial estudá-lo :)
Ah, para responder a pergunta não vale procurar no Google! ;)

sábado, 5 de julho de 2008

Quando o equívoco se torna um acerto




Continuando do post abaixo, fiz o L-15 em pó. Na verdade, ele só estava na minha geladeira porque nosso representante Marco Aurélio se equivocou e me trouxe L-15 em pó, em vez de líquido. Quis trocar, mas o Mauro achou melhor ficarmos com o pó para mais tarde testarmos – além de ser uma grande economia: na embalagem vinham 10 vidros e cada um fazia 1L de meio! Confesso que fiquei descrente, como sempre. Vivia dizendo para mim mesma fazer o pó para assegurar que funcionava. Fui enrolando, enrolando... contudo percebi que chegara a hora. Calculei o peso do L-15 em pó para fazer 200mL de meio, pesei o HEPES para 25 mM (alguns artigos diziam 20, outros 25 mM...). Dissolvendo, ficou rosa, como imaginei, mas o pH estava mais baixo, 8,5 se não me engano. Fui adicionando HCl e voilà! Consegui chegar a 7,2!
Filtrei com o filtro pequeno, usando a seringa grande (deu trabalho!) e o líquido ficou praticamente da mesma cor que o comprado pronto.

L-15 em pó (esq) e o de garrafa (dir)

Agora faltava testar... Mas antes, gostaria de fazer um parênteses sobre a polilisina. Neste meio tempo de tentar acertar o HEPES, peguei na Silvana um pouco de solução de polilisina para testar, pois esse polímero ajuda na aderência das células. Testei em umas plaquinhas que não são muito boas e realmente a aderências das células foi maior com a poli-, tanto no controle como no Cádmio. Bom, muito bom... fecha parênteses.

Fiz plaquinhas para testar o meio novo. Senti bom sinal ao ver que o L-15 não ficou amarelado quando eu adicionei o Cd, o que significa que o pH se manteve estável. Após 24h, ao olhar no microscópio as células estavam ótimas, tanto controle quanto cádmio, muitas células aderidas. Chegou a hora da verdade: o vermelho neutro...tcham tcham...

CONTROLE: células ótimas, aderidas e muito pouco coradas. Há muito tempo que não via as células assim, citoplasma limpo, ou com alguns pequeninos lisossomos.
CÁDMIO: células aderidas e...coradas! Sim, finalmente as células não estavam mais com aqueles aspecto amarelado, redondas, elas estavam coradas, até havia algumas que não estavam. E havia mais células soltas do que o controle, como eu imaginei, umas coradas, outras não.

Vi uma célula especial, acho que do cádmio, com grânulos (eterna dúvida, grânulos ou lisossomos?) e um vacúolo enorme. Me distraí e quase perdi a hora do Praça XV! Deixei algumas coisas sobre a bancada (desculpa ju, eu arrumei no dia seguinte)desliguei tudo, tranquei a porta e saí correndo!

sexta-feira, 4 de julho de 2008

O problema do HEPES

No final deste post escrevi que o Mauro sugerira de um fazer HEPES que ficasse a uma concentração de 20 mM no L-15. Então, tive a idéia de fazer uma solução bem concentrada de HEPES para adicionar o menor volume possível ao L-15. Fiz os cálculos para 2 M, o que me faria adicionar algo em torno de 10 uL/mL ao meio.
Mas como sempre, tive problemas, e como sempre, tentei resolvê-los. Uma verdadeira Saga de Hades (rs)

1ª tentativa: a massa de HEPES a ser pesada era de 26g...para ser diluído em apenas 50 mL! Adicionei 40 mL em um béquer e vamos à diluição. No fim, o volume havia mudado para 60 mL! A Ju sugeriu de eu pesar mais um pouco para completar 75 mL de solução a 2 M. Deu certo. Agora, ajustar o pH: de 11 para 7,5. Pinga HCl. Pinga, pinga...nem sei o quanto de volume coloquei mas foi grande e nem chegou a 8,5! Desisti.

2ª tentativa: Diminuí a concentração para 1 M (o que reduz a massa para 13g, mantendo o volume de 50 mL) – agora não lembro se foi por causa do problema do volume ou do pH. Consegui diluir e avolumar para 50 mL. Hora de ajustar o pH. Desta vez eu medi no lab da Silvana, pois o nosso estava sem eletrodo.Continuou 11. Pinga HCl. Pinga...pinga...pinga...e o pH precisava estar em torno de 7,5, só que eu já tinha adicionado 4 mL de HCl e nem a 8 chegou. Mais uma vez, descarte, pois 4mL é um volume considerável e com certeza alterou a concentração da solução. Desisti.

3ª tentativa: Fiz novamenta a solução a 1M, mas desta vez usei o Ac nítrico CONCENTRADO (mais ou menos 80%) , direto da garrafa, para ajustar o pH, após longa conversa com o Mauro sobre grau de dissociação de um ácido. Vai para a capela com pHmetro de bancada, agitador magnético, luvas. E aconteceu como nas outras vezes: pinguei 80 gotas com a pipeta Pasteur (nas outras vezes usei micropipeta 1000uL). Achei muito e calculei o volume: 1 mL = 20 gotas, 80 gotas equivale a...4 mL... Desisti mais uma vez.

O que acontece é que o HEPES é um tampão, ou seja, ele não permite grandes variações de pH e sua faixa de tamponamento é de 7,5 a 8,5 mais ou menos. Ou seja, se a solução estiver nesta faixa, você pode pingar ácido ou base (quase) à vontade que o pH se mantém estável.
Procurei por protocolos no site protocol-online.org e fiquei surpresa ao ver que eles ajustavam o pH com NaOH! Como é possível, se a solução já estava básica? Pensei que fosse assim devido a alguma reação química do tipo íon comum, ou algo que desconhecia. Mas reparei que o HEPES usado por ele tinha peso molecular diferente do meu. Procurando nos catálogos de reagentes (eles não servem apenas para apoiar monitores de PC rs) vi que existiam dois tipos: Sodium Salt (o que eu tinha) e o Free Acid (que ao contrário do que pensei, não é livre de ácido, mas sim que libera ácido livre). E a diferença entre os dois era a presença de Na e ausência de H no Sodium Salt. Pronto, estava explicado, era esse o motivo.
Perguntei para a Tatiana (irmã da Ju) se ela tinha o HEPES free acid (que libera ácido) mas o que ela tinha era igual ao meu. No lab dela eles trabalham muito com culturas e conversando ela me disse que o HEPES é pesado junto com o meio em pó. Porém, meu meio era líquido e estéril. Por isso que eu queria uma solução concentrada...
Aceitei a sugestão dela e decidi fazer (após falar com Mauro, claro) o L-15 em pó que há meses está na geladeira.

sexta-feira, 6 de junho de 2008

Cortando o presunto

Nesta terça eu e a Cíntia fizemos alguns cortes do meu material para a microscopia eletrônica de transmissão (MET, em português e TEM em inglês). Até que foi bem rápido, pois a pirâmide do bloco já estava "no ponto" pra corte (quando fazemos um bloco novo, temos que ir cortando a pontinha deste bloco, feito de resina, em um formato triangular, bem pequenininho. Então esta pontinha é cortada com uma faca e$pecial, de diamante). Então foi só encaixar as peças e deixar a máquina fazer o resto - ainda bem que é automática). Os cortes, acolhidos em uma banheira com água, estavam muito bons, bem dourados. A cor indica o quão fino o corte está, e a cor dourada de ser um corte de 0,2 micrômetros. Se estiver púrpura, por exemplo, tá grosso demais para a MET, pois o feixe de elétrons do aparelho não conseguiria atravessar o corte.

O triste depois é pescar os cortes. Tem uma gradezinha especial (usamos de cobre) onde colocamos o material. Mas primeiro, temos que dar um mergulhinho no ác. nítrico, para retirar possíveis gorduras - senão o corte não gruda). Mas esse banho tem que ser um mergulhinho, e rapidamente lavar com água: ou então não há mais grade :D, como aconteceu com a Paula rs.

Acho que pior que pescar é separar os cortes entre si. Imagina: você vai fatiar uma peça de presunto. faz a primeira fatia, e chega a peça para o lado; faz a segunda fatia, que fica parcialmente sobre a primeira, e assim vai, até formar uma fileira grande. Agora, você precisa colocar estes presuntos fatiados em uma tábua, mas a fileira que vc fez ficou grande demais. O que faz? corta o pedaço da fileira que caiba na tábua. É isso que tem que fazer: dos cortes seriados, tenho que separar um pedaço que caiba na grade. Simples, mas o problema é que os cortes, ultrafinos, estão boiando na água, e se pressioná-los demais eles afundam. E não é nada fácil desgrudá-los...deveria ter uns, sei lá, quase 80 cortes e fiz 5 grades com 4 cortes cada. Ou seja, dos 80, aproveitei 20, sendo que a maioria afundei rsE depois de pescados os cortes, as grades vão para o...porta-grades. Uma caixinha com vários buraquinhos numerados para guardar os cortes até a hora de usarmos...

domingo, 11 de maio de 2008

Escondendo o ouro

No Ecotox, somente um poster falava de vermelho neutro (e muitos continham micronúcleo e ensaio cometa); o pôster da Iara, capixaba gente finíssima. Enquanto aguardava ser avaliada, conversamos muito sobre nossos trabalhos, que, apesar de abordagem diferente, empregava o mesmo corante, VN. E também trabalhava com hemolinfa, mas de perna perna.
Expliquei sobre minhas dificuldades em distingüir céls estressadas e não estressadas (coradas e não coradas) e lhe perguntei como ela fazia na sua metodologia. Eis que ela me fala que não conta cél por cél, mas analisa a lâmina por inteiro, e classifica a lâmina em +; +/- e -. E usa as características (são 7) indicadas por De Pledge (um dos co-autores de alguns trabalhos do Lowe) e que NÃO ESTÃO PUBLICADAS EM ARTIGO ALGUM. E que ela teve acesso porque a orientadora (acho) fez um curso (caríssimo) com esse pesquisador, e é neste curso que ele discorre sobre tais características.
Então me pergunto: por que ele não publicou? por que esconder o "pulo do gato?" Poxa, isso é uma técnica, uma metodologia, e como tal deveria ser (bem) descrita, pois é uma ferramenta que poderia ser usada por outros pesquisadores. E será que os autores dos diversos artigos que já li contendo em seus materiais e métodos "Lowe e al" estão cientes destas tais características?
Apesar de pouco ter aproveitado das palestras, só este conhecimento fez valer o congresso inteiro. Mais um (excelente) contato. E o melhor, aqui pertinho no ES. Acho que vou aproveitar as promoções da Gol e fazer uma visitinha rsrsrsrrs

X Congresso Brasileiro de Ecotoxicologia - Bento Gonçalves, RS

Entre os dias 30 de maio e 3 de junho ocorreu o X Congresso Brasileiro de Ecotoxicologia, do qual participei apresentando pôster. Fomos eu e Ju, para Bento Gonçalves.

30/04/08 – quarta-feira:
Nosso vôo (pela Ocean Air) não atrasou, chegamos por volta das 19:30 no aeroporto de Porto Alegre e nosso transfer até Bento saiu pontualmente às 21h. Chegamos em Bento às 22:40, e infelizmente perdemos a abertura oficial e o coquetel. Fomos para hotel.

(em off): Muito, muito, muito frio. Sorte que havia aquecedor no quarto e nós, cariocas, desconfiadas em ligar o artefato, pedimos ajuda ao recepcionista que fez uma coisa muito difícil: ligou o aparelho na tomada e os dois botões

01/05/08 – quinta-feira
A Ju acordou cedo para ir ao mini-curso. Mais tarde levantei para ir ao Hotel Dall´Onder retirar meu material, mas lá descobri que deveria fazer isso no centro de convenções. A recepcionista do Hotel me deu um mapa da região e me explicou como chegar nos lugares básicos (shopping, rodoviária, centro de convenções). Esperei a Ju sair do mini-curso, almoçamos num shopping (fomos andando até lá), voltamos ao nosso hotel (andando também) para pegarmos meu pôster. O ônibus que levava ao fundaparque (o centro de convenções) fez a gentileza de nos esperarmos enquanto saíamos correndo para pegar o pôster.
A mesa redonda 1 (Qualidade e confiabilidade analítica em análises ambientais) , de início, não animou muito, mas o Alexandre Arenzon (UFRGS) expôs alguns pontos interessantes sobre determinadas variáveis que podem interferir nas análises de animais usados em experimentos exotoxicológicos).
A exposição dos pôsteres foi após o coffee break Na hora da avaliação, fiquei anciosa, claro, e como sempre acho que falei correndo demais. Expliquei minhas linhas de pesquisa – efeitos dos metais e caracterização do hemócitos por MET – o porquê de ter obtido resultados inversos do esperado.
Como fui uma das primeiras a ser avaliada, dei uma olhada nos pôsteres que me chamaram a atenção no livro de resumos. Somente UM,UNZINHO, tinha vermelho neutro – a da Iara, mestranda, UFES. Ficamos batendo um bom papo e descobri coisas interessantes...
A palestra 2 (Great ideas in ecological risk assessment), em inglês, foi interessante, mas pouco me lembro porque não entendi muito bem, logo não consegui anotar nada.

(em off): o pavilhão é tipo o riocentro. Deu a impressão que fazia mais frio lá dentro do que do lado de fora. Estava começando a choviscar quando fomos embora. Tínhamos um convite ($6) para a “festa da salmonella” num bar perto do Dall´Onder. Pelo nome e pelo frio, decidimos não ir. Rsrsrs

02/05/08 – sexta-feira

Pela manhã havia diferentes atividades, e optamos por assistir ao workshop, que a partir das 10h foi sobre biomarcadores morfológicos e genéticos (Ciro Ribeiro, UFPR) e após biomarcadores bioquímicos e fisiológicos (Montserrat, FURG; Adalto Bianchini, FURG e Helena Cristina da Silva de Assis, UFPR). Ao final, perguntei para o Ciro sugestões de como proceder na caracterização dos meus hemócitos, já que não há literatura disponível. Ele sugeriu que eu começasse como referências céls de vertebrados, que já estão bem descritas.
De tarde, fomos à Farroupilha, uma cidade vizinha que vende roupas mais em conta que em Bento. Precisávamos ir lá comprar roupas, porque o perrengue tava grande. Comprei um bom casaco, a um bom preço (apesar de ter descoberto um rasgo, mas nada que não possa ser costurado) e a Ju também comprou. Teríamos assistido à ultima palestra às 18:30 se o ônibus de volta pra Bento não tivesse atrasado quase 30 min.

(em off): Voltamos da rodoviária para o hotel à pé, na chuva. Pedimos um crepe para jantarmos (8,90) mas pagamos “quinze com vinte” (15,20) – a diferença cobria a taxa de entrega e as embalagens! Deu vontade de ir lá e devolvê-las...

03/05/08 – sábado

Atividades somente após o almoço. Agora bem aquecidas com nossos novos casacos, passamos no shopping Bento Gonçalves para tirar dinheiro e comprar coisinhas para comer. Para ir ao fundaparque, pegamos o ônibus municipal (que demorou bastante) e nos deixou bastante longe do fundaparque. Sob chuva e forte vento, chegamos encharcadas no pavilhão. Assistimos o finalzinho da mesa-redonda. Na hora do pôster, momento em que visitaria os trabalhos que marquei no livro de resumos, surpresa: muitos dos pôsteres, incluindo os do meu interesse, não estavam mais lá, provavelmente porque seus donos regressariam no sábado mesmo. Uma pena. Meu pôster não foi pré-selecionado.
Papeando com um grupo de paulistas, descobrimos que a última palestra do congresso, marcada para às 19:15h, fora adiantada (e lá fomos nós assistir ao finalzinho).

(Em off): Jantar de confraternização – muito bom gastronomicamente, mas muito ruim musicalmente. Só um cara no violão e outro nos atabaques. Música de barzinho deprê. Poucos na pista dançando (só coroas). Animou um pouquinho depois que Iara e eu pedimos um samba rs mas não foi o suficiente, e fomos embora.
Conclusão geral: Em relação às palestras, havia pouca coisa ligada diretamente ao meu trabalho; o local não era de fácil acesso, ficamos meio dependentes de táxi, mas dividíamos com as gurias que tb estavam hospedadas no mesmo hotel, pois não dá pra andar a pé na chuva e no vento; foi bom para fazer contatos "quentes".

terça-feira, 22 de abril de 2008

até pra isso o google serve...



Tenho que expressar o meu estarrecimento - pra não dizer boquiaberta - sobre como eu achei o artigo que venho buscando há meses (com alguns longos intervalos entre as buscas, claro).

Admito que sou péssima em procurar coisas, e isto inclui artigos. mesmo com a referência completinha, tirada dos dados bibliográficos, abro sciencedirect, periodicos capes, web of science, agora tb monte sinai e nem tchum.

Um exemplo: a silvana me mandou umas referências legais que um pesquisador alemão mandou. revista: aquatic biology, e eu procurando por aquatic toxicology. e ainda mandei email pra sil dizendo q não tinha online ainda rs. Bom, fui procurar pela aquatic biology, e não achei nos sites de busca citados anteriormente. Perguntei a ela como tinha conseguido, esperando como resposta um site de busca que eu desconhecia, e como resposta: "google".

Juro que duvidei. não da sil, mas duvidei que o google poderia me fornecer um artigo que não achei (incompetência?) no sciencedirect & cia. e hoje tirei a prova. procurei no google o tal artigo que eu queria. e eis que ele me aparece. duvidei mesmo, até porque a revista, "zoological studies" é específica do japão e adjacências, pensei "ah, por isso que não tem nos portais de pesquisa". mas nada, nada está além do google. e novamente, para até eu mesma crer, o artigo estava ali, no meu monitor. salvei rápido, do jeito que tá chovendo aqui, é capaz de faltar luz...
E Mauro, vou postar já já o artigo que vc me mandou. ele não é fácil, tô tentando extrair o máximo.

sábado, 12 de abril de 2008

Vídeo de apoptose

Mais un vídeo legal que a Ju me deu, e tava perdido lá no meu email. Para quem fala que no youtube só tem coisa que não presta... estã enganado...
Eu vejo isso acontecer muuuito com as minhas céls, quando já não aconteceu praticamente com todas... é incrível como essa coisinha tão pequenininha não é estática! Sempre vi a cél, desde o E. Médio, que ela estática. Até mesmo depois de ver alguns vídeos tirados do The Cell na aula de bio geral, continuava achando que era "mentira" (mentira, muuuito entre aspas, viu?) rs Até eu ver cara a cara, tête-a-tête, no estágio...
não é um máximo?!

sexta-feira, 11 de abril de 2008

O plástico

Para exemplificar bem o post abaixo.

No livro Eureka!, q eu já comentei aqui, fala sobre a descoberta (e não invenção) do plástico. A princípio, o polietileno (vulgo plástico) só era obtido a temperaturas muito altas, o que encarecia sua produção em larga escala, além de ser pouco resistente. Até que uns químicos doidos - um pós-graduando, claro, estava tentando sintetizar hidrocarbonetos c/ átomos de alumínio, e utilizava o gás etileno. Como sempre acontece, nada disso deu certo: ele via que as moléculas de etileno se formavam aos pares. Eles investigaram e viram que isto estava sendo causado por resquícios de níquel de outros experimentos, onde eles estavam trabalhando. Eles mudaram o rumo (ou acrescentou uma linha nova de pesquisa no lab) e tentaram verificar se era possível produzir longas cadeias de etileno (polietileno). Não só era, como o processo era bem mais simples que o anterior, e não só isso, o produto era bem mais resistente que o primeiro. Mas como cientista é uma alma inquieta, os caras lá foram testando outros metais atuando como catalisadores. Essas misturas (orgânico + metais) ficaram conhecidas como "catalisadores Ziegler-Natta".

Agora a parte mais interessante, na íntegra:

"Ironicamente, mais tarde soube-se que os químicos da equipe de Ziegler não foram os primeiros a obter polietileno por este processeo. Em 1943, Max Fisher, nos laboratórios BASF, usou uma reação semelhante para produzir óleos lubrificantes sintéticos a partir do etileno. Ele percebeu que, além do óleo, a reação sempre formava uma grande quantidade de um pó branco. Ignorando do que se tratava, apenas jogava fora o resíduo como um produto indesejável, desse modo deixando de ganhar um Prêmio Nobel e um lugar na história da química."



Não sei se o Rupert Lee, autor do livro, foi, digamos, dramático demais, mas quando li o texto (após fazer o post abaixo) me deu uma vontade louca de postar aqui. Quando li, até eu fiquei com raiva do Fisher. Mas fazer o quê, ele ia advinhar? Imagina cada um de nós perdendo tempo em analisar cada resíduo produzido em nossos experimentos? rs E também fiquei imaginando, "será que ele soube? Como deve ter se sentido?"
...e espero que eu não seja acusada de cópia ilegal. Esse trecho é menos que 10% da obra!

quinta-feira, 10 de abril de 2008

Uma sugestão do Francesco

Francesco é um fofo. :D Pena que ele não sabe português para ler estas palavras. rs
O Mauro contou a ele sobre nossos problemas com o VN. Voltando do almoço (ele indo), ele me falou a opinião do Francesco, que talvez o motivo seja que a membrana do lisossomo esteja tão, mas tão danificada, que não consegue reter o corante. Tá, mas então a cél (seu citoplasma)deveria estar corada, certo? Segundo o Fran, o corante não ficaria no citoplasma porque seu conteúdo não é ácido, e o corante tem afinidade por meio ácidos, logo ele sai da cél. Então, aquilo que eu via no ctrl, as céls com "bolotinhas" vermelhas (os lisossomos com VN), significa justamente o contrário do que achava, ou seja, aquilo sim que é a cél boa, pois ela consegue reter o corante... tadinha, e eu colocava ela no grupo das coradas...tanto que, com o passar do tempo, esses lisossomos crescem (veja o filmezinho que fiz, como os lisossomos tão grandes!), e vai aumentando a chance de se romperem. Agora sim, tudo faz sentido. Eu lia nos artigos dizendo q o tempo de retenção pra céls saudáveis é de 180 min em média. (Tempo de retenção é o tempo que leva para que 50% das céls estejam coradas. Por ex, no tempo 1, do total de céls contadas apenas 10% estavam coradas; em t2, 15%; t3, 25%...t qualquer, 50%. Pronto, aí pára de contar e esse tempo, 30min, 1h,2h...etc, será o tempo de retenção. Claro, tem vezes que cél é tão boa, mas tão boa, que fica lá, mais de 2h, 2h e meia retendo...como também há vida out do lab, estabelece-se um tempo máximo, que mesmo não tenha chegado a 50%, a contagem é finalizada. Simples? Levei bastante tempo pra entender, o Mauro tentou me explicar diversas vezes, e eu com aquela cara de "hein?!"). E minhas céls, do ctrl tinha os tais 50% logo nos primeiros 5min!!!
Então, a estratégia agora é observar mais cuidadosamente os lisossomos, e contar como céls corada somente as com o citoplasma corado. Mas... e o que fazer com aquelas que tem uma leeeve coloração, como se um, unzinho lisossomozinho tivesse rompido?
Outra coisa, isso resolve o ctrl, mas ainda ficamos pendurados com os tratados. O Mauro falou para colocar HEPES (um tampão), que fique a 20 mM no L15. Vamos testar, então.

Dúvidas...

Bom, não publiquei antes porque a seqüência “seminário-prova + estudo dirigido de evolução-relatório do estágio” me deixou sem tempo. Mas aqui estou.
Na segunda fiz uns pocinhos para corar com o Tripan. Na terça, após o seminário, fui contar. Perdi os dois primeiros pocinhos do ctrl pq a burra aqui esqueceu de filtrar o Tripan, então mal dava pra achar cel no meio de tanta sujeira, de tanto particulado. Ao dotal fiz 8 poços ctrl e 8 poços tratado com Cd a 1 uM. E o resultado de ambos foi parecido (preciso aprender de vez a fazer gráfico no Statistic!). Uns poços coravam mais (ao em torno de 89 coradas p/ 200 e poucos ñ coradas), outros menos (20 coradas para os mesmos 200 e tanto). Ou seja, o Cd de fato não está matando as céls. E as que coravam eram muuuito pequenininhas. E cada vez mais me convenço que certas céls lá não são hemócitos, mas sim algum tipo de contaminante. Preciso ligar aquela câmera já!!!

Outra coisa interessante que “descobri” enquanto esperava corar o poço: pequei no L-15, com as cels soltas que eu imaginava ter, claro, e pus em um poço limpo. De fato, tinha várias céls, mas o interessante é que elas me pareceram aderir, e algumas até a dar uma leve espraiada. (Para saber se a cel tá solta ou não, dou uma sacudida de leve na mesa; se ela se mexe, é porque está em solução, ou seja, solta). Isso é bom pra mim, pois quando precisar tirar fotos boas, seja da própria cél, ou ela corada com o VN, o Tripan, etc, basta colocar em uma lâmina e fotografar no maravilhoso mic da Sil.
Mas o que me intriga é: a cél tava solta; então pus em outro poço, limpo, e logo ela aderiu...ou seja, ela pode até ta baleada com Cd (este testezinho fiz com as céls tratadas), mas ela ainda tem essa capacidade de aderir...

Às vezes fico divagando com essas coisas. Você estudar um determinado objeto, e mesmo que já tenha todo o planejamento do que estudar, do que focar, sempre vai aparecer algo inesperado, como uma pequena tentativa dessa que fiz – eu achava que cél solta era cél f**, morta, etc – ou algum erro que gerou um resultado intrigante (quem não lembra da penicilina? O Eureka! Que o Mauro me emprestou mostra que tantas descobertas foram feitas por acaso!) – E o que fazer quando isso acontece? Desvia dos teus objetivos, parcial ou totalmente, ou ignora, e continua no previamente caminho traçado? Temos que ter foco, claro, mas até quando ele deve ser respeitado?



" O acaso só favorece aos espíritos preparados e não prescinde da observação".

segunda-feira, 7 de abril de 2008

... Ficou rosa!!!


Nem ia escrever hj, mas depois do cochilo maravilhoso que tirei no ônibus (o piloto apagou todas as luzes! aquele buzu maravilhoso, poltrona acolchoada...) me animei.


Hoje fiz uma placa (16 poços, somente) só para ver tripan. A concentração de Cd que usei foi a mesma, de 1 uM. Sobrou um restinho de L15, então resolvi pôr em prática uma idéiazinha hehehe (Mauro, não briga rs)
Já que o L-15 tem phenol red, que é um indicador d pH, e a coloração fica amarela em pH ácido (por volta de 6), será que seu adicionar NaOH vai voltar a ficar vermelho?

Então, pequei o restinho de meio que sobrou, adicionei o cloreto de cádmio para que ficasse a
1 uM (como sempre faço). Cor: amarelo. Peguei a solução de NaOH a 1 M e adicionei 20 uL. INSTANTANEAMENTE ficou.... da cor da flor aí do lado. Claro que não era a cor que eu queria, mas mostra que se o pH mudar de novo, o indicador também muda. O que siginifica que posso usar para ajustar o pH com o NaOH, sem necessitar de fitinha ou ter que mergulhar o eletrodo do pHmetro no meio com Cd. Só diluir um pouco o NaOH (1 M é muito contrado) e ver o menor volume possível para adicionar ao meio, sem alterar muito o volume inicial.

domingo, 6 de abril de 2008

O mistério perto do fim...

Quem disse que papear no msn é perda de tempo?!?!?!
Ontem eu e Ju, nos gostamos tanto, mas tanto, que além de convivermos praticamente todo dia no cafofo, ainda temos papo pra ficar no msn. Os assuntos podem ser vários, mas ontem foi principalmente sobre o meu exp d sexta, do azul de tripan.
Ah, antes de tudo, ela me passou por email um artigo bombástico: “Crystallization of neutral red vital stain from minimum essential medium due to pH instability”. Mas claro, todo artigo bombástico nunca está disponível na web. Se eu tiver sorte, encontro na biblioteca do CCS (tem o periódico, mas o artigo...sorte!!!) De fato, logo quando começamos os experimentos com Cd, percebia-se nitidamente que o L-15 mudava de cor, de rosa/vermelho para amarelo ao add o Cd. Medi o pH, mas tava entre 6 e 7 (usando a fitinha de cores). Td bem. Agora nos ocorreu de comparar o pH do meio sem e com Cd. Diferença de 1 ponto, para baixo, ou seja, o Cd acidificava o meio.

Meio de cultura Leibovitz L-15

E papeando pelo msn com a Ju, ela continuou investindo q o problema era o pH, e realmente é o que parece ser. Até q ela perguntou se o L15 tinha alguma substância indicadora de pH. Lembrei de um nome, e fui no site da invitrogen para lembrar: phenol red. Bastou uma procurada no Oráculo para descobrirmos que essa substância é... um indicador de pH!!! E advinha que cor fica quando o pH se torna ácido???
Juntando essa informação com a do artigo... (me senti agora um Watson&Crick juntando os dados da Rosalind Franklin e fazendo a descoberta do século!). Uma boa justificativa que responde às indagações do post anterior, de porque que as céls (vivas, como assegurou o tripan) com ñ coram com VN, mas o ctrl, sim. Porém, outra pergunta: então por que quando eu colocava a placa na geladeira (mais ou menos 6ºC) as céls com Cd coravam (exceto 2uM)? Segundo a Ju, devido à diminuição da fluidez da membrana. Mas isso pra mim ainda não está claro.
Outro questionamento: o L-15 não deveria ter um tampão?! Ó o que ta escrito no site da invitrogen, sobre o L-15: “L15 formulations were developed without a sodium bicarbonate buffer system. L15 medium is buffered by phosphates and free-base amino acids (L-arginine primarily, but also L-histidine and L-cysteine)”. Será que o Cd acaba ultrapassando a “faixa de tamponamento”?
Enfim, agora é arrumar um jeito de corrigir o pH do L15 com Cd (será que de amarelo vai ficar vermelho/rosa novamente)?.
E Ju, só pra deixar público, muitíiiiiiiiiiiiiiiiissimo obrigada pela força. Toda semana essa menina me dá um artigo novo, e artigo dos bons! Fico até com vergonha de não procurar direito hehehhe

O azul de Tripan... They´re not dead!

Sexta fiz o ensaio do azul de tripan. Apesar de eu ter errado num pequeno detalhe – por causa do sono, cansaço e pressa, falei pra ingrid pôr uma ostra para controle 1, uma ostra para tratado 1, 1 ostra pra ctrl 2 e 1 para tratado 2... porém idéia era justamente o contrário, que cada poço de cada trat e ctrl fosse uma ostra diferente, assim teríamos uma variabilidade biológica (certo Mauro?) O experimento foram oito poços ctrl e oito poços tratado com Cd a 1 uM, sendo que 4 ctrl e 4 tratado seriam só para azul de tripan e os outros 4 ctrl e 4 tratado, para Vermelho neutro e depois, o azul d tripan.

De início comecei pelo VN, mas lá pelo terceiro poço, decidi fazer as linhas só do tripan. Afinal, a nossa hipótese era que o Cd estava matando as céls, e por isso q o VN ñ saía do lisossomo para o citosol, ou pior, talvez sequer estivesse entrando na célula. O resultado é que as céls NÃO coraram com o tripan, ou seja, estavam vivas. E o tratado continuou a não corar também. Levei quase três horas pra contar os poços, e quando voltei aos primeiros poços, o VN estava bem mais forte, claro, com vários lisossomos grandes, quase ocupando todo o espaço do citoplasma. Mas tripan, nada. Somente pouquíssimas céls (4 dentre 250, por exemplo) é que coravam com o Tripan, e mesmo assim não eram as céls q estavam aderidas – havia muitas – mas céls muito pequenas, e só tenho certeza de ser céls pq já li vários artigos falando sobre, e na objetiva de 40x dá pra ver.
Bom, sobre o controle do “somente” tripan, tive outro problema: como esse controle foi feito com uma ostra somente, havia céls estranhas, grandes, com grânulos muito também grandes e amarelados, e que estavam espraiadas antes de adicionar o corante. O curioso é que após adicionar o corante, elas adquiriam a forma arredondada. E tive a impressão que elas espraiaram de novo após retirada do corante. Interessante, mas me serviu de nada pois não corou com tripan, e esqueci de pôr o VN só de curiosidade (a fome tava dilacerante e queria pegar o finzinho do coffee-break do ministro; tadinha, quando cheguei só sobrou um mísero copo de refri). Esse tipo celular me aparecia bastante quando eu tava iniciando as culturas, até já comentei com a Barracco, e provavelmente deve ser algum parasita. Ia tirar foto, mas ALGUÉM desconectou a plaquinha da câmera do laptop, ou pior, tirou o pininho amarelo (que conecta a câmera na placa) da placa. Tentei encaixar mas não ficava, parecia que faltava uma pecinha, que estava quebrada.
Enfim, gostaria de fazer mais uma placa pra ratificar que esse Cd não está atingindo as céls, pelo que parece, já que o ctrl tava bichado. Mas assumindo que isso seja ratificado, agora a questão é? Por quê? O mauro falou que possivelmente as substâncias contidas no meio de cultura estariam quelando o Cd, deixando-o indisponível ao contato com a cél, logo não estaria fazendo “efeito”. Tudo bem, mas isso não justifica que o tratado esteja totalmente livre do corante. Se o Cd está indisponível, ao menos as cels deveriam se parecer com o ctrl, o que não ocorre tanto na coloração do VN quanto na morfologia. (Aliás, a coloração do ctrl é discutível em outro tópico). Eu poderia fazer uns testes aumentando a concentração do Cd, e fazer em paralelo (não por cima) o VN e o tripan.
Outra coisa que me ocorreu é de aquela solução de Cd já estar com “o prazo de validade vencido”; por exemplo, a tampinha do vidro de H2O2 a 10mM já briu sozinha tantas vezes que ali deve ter só água rsrsrs. Lembro de uma conversa com o Rodrigo no avião, voltando de Floripa, ele me dizendo para trocar os reagentes, soluções, etc, fazer tudo novo.
E por falar em soluções, tenho que verificar a salinidade do tripan. Eu fiz a 0,4% em PBS, como tá na literatura, mas salinidade é 1 problema sério para nossas céls, apesar de na sexta não ter visto nada de anormal (a não ser as céls estranhas encolhendo). Talvez eu tenha que fazer um tripan novo, com o PBS ajustado à salinidade.
Outra coisa que me preocupa também é as ostras lá no aquário. Ando muito relapsa, sem verificar a salinidade e pH (apesar de não ver a importância desse parâmetro muito discutido) e TEMPERATURA. Muitas vezes ia pegar umas ostras e a água tava bem quente, principalmente na segunda, após fim de semana. A Ju sugeriu de ela trazer um aquariozinho para colocar umas ostras e deixar na 32, com o ar ligado, pra ver se há alguma diferença, ou fazer isso também quando chegar ostras novas. That´s all, folks!

terça-feira, 1 de abril de 2008

Agradeço a Hitler...

Calma gente. Antes de saírem detonando meu blog, leiam este post até o fim (pelo amor de Deus, não é nada sobre as atrocidades que ele cometeu!!!).
Terça teve uma palestra do Dr. Miquel Lurling da Wageningen University- Holanda, falando sobre o controle de cianobactérias no país dele. Palestra em inglês, óbvio. Assisti mais por esse fato doque pelo tema em si. Foi legal, mas se ele tivesse falado um pouquinho mais devagar, teria entendido um pouco mais.
Precisa-de de inglês. Hoje em dia, praticamente para tudo: qualquer profissão pede inglês como requisito obrigatório, e já estamos partindo para a aquisição de uma segunda língua estrangeira ser necessária. Na área de pesquisa, então, não saber inglês é como se não soubesse nem português, como se fosse um bebê que balbucia apenas sons e NÃO CONSEGUE SE COMUNICAR. Meu inglês é parco (mesmo minha teacher do curso, nativa dos EUA, dizer que tenho boa pronúncia e me expresso direitinho), principalmente porque não ouço direito. Não que tenha problema auditivo: mas meu vocabulário escrito é muito maior que o vocabulário "ouvido". Sempre tive muito contato com inglês escrito, portanto ouvir e entender um nativo falando pra mim é uma dificuldade imensa. Tenho melhorado, mas meu inglês está em no estágio de "mente lerda": eu entendo uma palavra que seja pouco usual e fico nela para achar o correspondente em português - enquanto isso a pessoa já falou mais umas cem palavras. rs Quanto mais palavras conhecidas em um texto, melhor flui... Achava eu, até descobrir que nativos não falam TO-DAS -AS-PA-LA-VRAS, pronunciando mais fortemente os substantivos, verbos, pronomes pessoais. O resto, é ´só um sopro, um balbucio, uma ligação com a palvra seguinte. Por isso que quase não entendo o que os nativos de língua inglesa - exceto os britânicos - falam, pela velocidade da fala e pelo famoso "ovo na boca".
Uma vez tentei ter aulas particulares com um professor de inglês nativo, dos EUA, que achei nos classificados do Globo. Nos encontramos eu, ele e a outra menina que dá aulas particulares junto com ele na Cândido Mendes, no Centro. O rapaz teve que repetir umas 5 vezes até eu entender "Stop to speak portugese!" E depois ele disse que nós, brasileiros falamos com a boca aberta. "Close your mouth" - disse. Até hoje não esqueço... Não resisti e retruquei: "Mas parecem que vocês falam com ovo na boca!" Acho que ele não gostou muito. rs
Bom, como disse, tenho progredido. Em aprender os sons das palavras que já conheço, aprender a ouvir os links das palavras (ou você acha que eles falam Do-you? naaaão, é algo como "dul", Will-you é "williu" e assim vai) e principalmente, palavras novas não deixo de treinar a escuta. Ou no mínimo olho no dicionário para ver a pronúncia - depois que aprendi o básico do alfabeto fonético, minha vida melhorou muuuito - agora sei que instead se fala "instéd" [inst'ed] e não "instíd" [inst'i:d] , head é [hed] "r" como em rato mas red [red] "r" é como...imita um gringo falando "retângulo" dobrando a língua. É isso aí. Poderia ficar falando horas sobre fonética [ADORO, PENA QUE NÃO TIVE NA FACULDADE...]. Mas chega.




Tô reclamando, como sempre, de aprender inglês, mas poderia ser pior. Muito pior. Se não fosse por Hitler, nós do ramo científico teríamos que aprender...Deutsche! Isso mesmo, alemão! Isso porque no até meados de 1930 o celeiro da ciência estava concentrada na Alemanha, Áustria e Suíça. Entre 1900 e 1932, dos 100 prêmios Nobels concedidos em ciências, 33 foram para alemães e suíços: oito deles. Judeus. Então Hitler entrou em ação...e "expulsou" os judeus da Europa oriental, e eles se refugiaram onde? Acertou quem disse Inglaterra e EUA. Portanto, eles começaram a publicar em períodicos desses países, de e em língua inglesa.

E fico imaginando como a Gi e a Dani tão se virando lá em Munique...
PS.: Essa informação tirei do livro "Eureka! - 100 grandes descobertas científicas do século XX" do Rupert Lee, que o meu querido orientador me emprestou. Muito Muito Muito bom, tanto pelas histórias que ele conta, com uma simplicidade incrível, quanto pelo poder de síntese do cara, q conta cada descoberta em somente duas páginas. E tudo faz sentido. Acho que vou comprar esse livro pra mim! E acredite: ele salvou uma questão na prova da preifeitura q fiz hoje, sobre bactéria e sulfonamida!!!






domingo, 23 de março de 2008

The PCR song

A Ju me passou esse vídeo. Lembrei que no PRIMO14 a gente - digo, eles - cantaram uma musiquinha neste estilo e foi muuuuuito engraçado...

vídeo aqui

Se vc é ruim de inglês que nem eu e entendeu nada, aí vai a letra desta música do vídeo para meus queridos leitores cantarem junto...
Em homenagem à Ju e à Andreza (que deixou nosso cafofo), que sofriam com os PCRs q ñ davam certo...

There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.
(Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.
Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases too.
Denaturing, annealing, and extending,
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.

[Chorus]
PCR when you need to detect mutation (detect mutation)
PCR when you need to recombine (recombine)
PCR when you need to find out who the daddy is (who’s your daddy?)
PCR when you need to solve a crime (solve a crime)
(2x)

quarta-feira, 19 de março de 2008

Meu primeiro vídeo!

ô mauro...lembra destas fotos? agora virou vídeo... parece aqueles videozinhos de céls q tem no CD do the cell, mas esse é muito mais legal..acho que vou levar um laptop pro congresso pra mostrar lá! Vai ser sucesso!!! no ciência viva então...a Eleonora ia amar! rs

Hein... e imagina os vídeos que daria pra fazer com aquele tal "time-lapse photomicrography do artigo... ops, ainda ñ postei ele!

A magia de ser cientista

Toda profissão tem seus vieses. Mas também suas alegrias. E não falo somente de ir a congressos, visitar labs fora da UFRJ (ou até mesmo dentro), fazer churrasco (ou ir à CADEG!!!!) no fim do ano.

Desde que entrei no estágio no radioiso venho tentando fazer uma cultura primária dos hemócitos. Procurei protocolos, testei, adaptei, e nada. Me perguntava (e até hoje me pergunto) "como eles fizeram para conseguir x% de céls viáveis?!" Mas eu não me dei por vencida.
Desconfiada que a centrifugação estivesse estressando demais as células (sem falar que são 10 min de centrifugação, depois ressuspende, etc), tirei hemolinfa (hl) e plaqueei direto. Sem centrifugar. Sem anti-coagulante. Pá-pum, simples assim. Geladeira (isso é assunto pra mais tarde). 24h depois e voilà! céls aderidas! céls não coradas de Trypan! Eu! Eu!Eu! Eu que fiz!!!

E essa semana, mais uma alegria ao sabor "eu que fiz" (made by Americo&Figueiredo). A ju não tava conseguindo extrair RNA da hl de jeito nenhum. Brânquia e Gl. digestiva, blz, tudo bonitinho. Já na hl...as razões lá que tem q dar no nanodrop tudo ruim, a quantidade era muuuito pouquinha... por ex, a razão RNA/ptn tem q tá em torno de 2 - o q significa que tem nenhuma ptn, pois o processo de extração separa o RNA do resto (ptn, carboidrato, lipídio). se tiver baixa, é pq tinha mt proteína. Tava dando 2,8 (o q significa? mt pouco RNA e mt ptn?)
E pensando, e pesquisando, sugeri: "centrifuga". Acho que fizemos isso 1 tempo atrás, com 1 ostra só. Desta vez tirei hl d umas 4 ostras, que deu no total 9 mL. Pellet buniiiiiiiiiiiito!!!! Faz o protocolo, tal tal... voilà!!!! melhorou!!!! RNA em excelentíssima quantidade, razão RNA/ptn ok...

mas nem td tava perfeito... a razão das absorbâncias 260/230 nm deu abaixo do ideal, o q siginifica que pode ter sido contaminação por trizol, etanol polissacarídeos, outros compostos compostos orgânicos, mts outras coisas. Então ela fez umas modificações no protocolo pra ver se dar pra melhorar essa razão. Mas mesmo que não der, fico feliz por já termos conseguido modificar as outras 2 variáveis q ñ estavam dando certo.

Mas o resultado só saberemos na segunda. sabe como é repartição pública, ponto facultativo...

Sydney rock oyster (Saccostrea glomerata) hemocytes: Morphology and function

Bom, como prometido, um apanhado desse artigo. Gostei dele pq ele fala sobre muitas das minhas dúvidas.
OBJETIVO: S. glomerata é uma das espécies mais importantes cultivadas em aquacultura, e é atacada por uma variedade de doenças infecciosas e infestação de parasitas. E os hemócitos participam de importantes vias de respostas imunes contra estes agentes infecciosos. Além disso, o estresse ambiental nas suscetibilidade e influência nas respostas imunológicas dos hemócitos contra tais os agentes. Sabe-se que temperatura, salinidade e poluentes químicos alteram as atividades dos hemócitos, e estes fatores podem aumentar a suscetibilidade das ostras a infecções. (TRADUÇÃO LIVRE DO ARTIGO)

Na literatura, é muito controversa a classificação dos hemócitos - pra invertebrado td é mais difícil. Mas é concenso que há pelo menos dois tipos padrão: os granulócitos - que possuem grânulos no citoplasma - e hialinócitos - que não os possuem, ou em quantidade muito reduzida. E dentro desss dois tipos é que as classificações podem variar, de acordo com a técnica empregada. neste artigo o autor usou algumas técnicas para criar classificações, baseada na morfologia (em microscopia de luz, de transmissão, de varredura) acido- ou basofilicidade dos grânulos ou citoplasma, tamanho e quantidade de grânulos, etc.

* Para caracterização, ele lançou mão das seguintes técnicas:

1) Separação dos hemócitos por M.O. (contraste de fase interferencial; “time-lapse photophotomicroscopy, que deve ser um aparelho fodástico, que ele tira fotos a cada 5s.)
2) coloração Giemsa/ May-grünwald
3) citometria de fluxo (site óootemo que achei pois ficava quebrando a cabeça de como o citômetro dava o tam. e a quantidade de grânulos nas células)
4) TEM (transmition electron microscopy)
5) SEM (scanning electron microscopy)

* além da caracterização morfológica, o autor também verificou a atividade fagocítica dos hemócitos, empregando os seguintes métodos:

- Imunohistoquímica para detecção de:
1) fosfatase ácida
2) peroxidase
3) fenoloxidase
4) superoxido
5) melanina

* Segundo o artigo, estas substâncias quando presentes no hemócito indicam se ocorre alguma atividade fagocítica. Peroxidade e fenoloxidade, por exemplo, estão presentes nos lisossomos, ou seja, atua como enzimas digestivas.

- Atividade fagocítica:
1) com S. cerevisae corado com vermelho congo
2) encapsulação com hifa de fungo

RESULTADOS

* para microscopia de luz:
Figura 1: Hemócitos em microscopia de luz e C de fase interferencial. Em A, temos a hemoblasto-like. Em B, hialinócito. Em C, granulócito. Em G, um agregado de cél, que graças a Deus ñ tenho visto muito nestas placas que ando fazendo, pois antes tinha muuuito deste tipo. quando tem, são de poucas células. em H, granulócito degranulado.

Abaixo, uma tabela resumida com as características que ele deu para cada cél:

Tabela 1: resumo da microscopia de luz

Graças ao aparelho que tira foto a cada 5s, eles verificaram que quem inicia a formação destes agregados são os hialinócitos, formando agregados pequenos, que aumentam de tamanho, e então "chama junto" os granulócitos, que começam a degranular!!! Logo pensaria: "ah, então os que se acham que é hialinócitos nada mais são que os granulócitos s/ grânulos..." nãaaao! eles viram q são hialinócitos sim. E como degranula? Os granulócitos formam vacúolos e encaminham seus grânulos para dentro destes vacúolos. E em alguns minutos tudo desaparece misteriosamente....rs


A Barracco já havia me falado que o granulócito de C. rhizophorae degranula. Eu também suspeito que uns pontinhos bem pequenininhos que vejo nas minhas placas sejam grânulos dos granulócitos. Mas uma foto tão bacana quanto a H...

Outra coisa que me surpreendeu: granulócito com auto-fluorescência em UV (figuras E e F)! Vai, por essa vc ñ esperava, ñ é?

Figura 2: Granulócitos sob luz UV

* Para citometria de fluxo:

Sobre citometria de fluxo, ele utilizou 5 individuos. Encontrou uma variabildade alta, mas pôde-se distinguiur basicamente 4 populações.
Em algumas ostras foram encontrados apenas R1 e R2, enquanto que em outras, foram encontrados todas as subpopulações. Ao observarem no microscópio, confirmou-se que R1 são granulócitos e R2, hialinócitos. Já R3 e R4 não puderam ser eficientemente classificados devido ao baixo número de células por região.

Abaixo, um resumo:

Tabela 2: Diferentes subpopulações de hemócitos classificados por citometria de fluxo

* Para Imunocitoquímica:

baixo, uma tabelinha resumida. As fotos estão bem bacanas, mas não vou adicioná-las aqui pois vai ficar imenso o post.

Tabela 3: Imunohistoquímica

Ou seja, todas as imunos deram positivas para todas as substâncias em granulócitos. Como eles fagocitam mais ativamente, há maior produção destas enzimas (fosfatase ácida, peroxidase, fenoloxidade) além de superóxido e melanina, todos envolvidos em processos de degração de corpos estranhos fagocitados por eles. Provavelmente por fagocitar menos, hialinócito deve não produzir, ou melhor, produzir quantidades muito pequenas destas enzimas.

FAGOCITANDO...

O autor viu que tanto granulócitos quanto hialinócitos tem habilidade de fagocitar, neste experimento ele utilizou o fungo C. cerevisae (péssimas lembranças...rs), sendo os granulócitos mais eficientes - teve um lá que fagocitou até 30 céls! Uma diferença interessante: os granulócitos não emitem filopódios para fagocitar ( ou então filopódios muito curtos): eles "engolfam" (verbo do artigo - engulfed) por invaginação da membrana. Já os hialinócitos emitem looongos filopódios.

Os granulócitos também encapsulam hifas (este processo ocorre qd a partícula estranha é mt maior que a célula). Alguns granulócitos ficaram em torno da hifa, e antes mesmo de ter algum contato, alguns degranularam. e no final de 40min, todos q estaavam participando do processo degranularam. No entanto, os hialinócitos pouco participaram deste processo. E também fizeram uma coloração para verificar a melanização destas cápsulas. Após uma pesquisa rápida no Oráculo - em fontes confiáveis, claro), a melanização ocorre após a ativação da cascata de fenoloxidase (PO), e este processo é uma resposta do sistema imune que também ocorre em vários outros invertebrados.

* Para TEM

Agora vamos p/ parte que interessa. Na TEM, ele divide os hemócitos em váaarios subtipos (4 sub- p/ hialinócitos e 5 sub- p/ granulócitos) baseados na razão citoplasma:núcleo (C:N), formato do núcleo, se forma ou não filopódio, se tem retículo (aliás aquelas "minhoquinhas" q a cíntia tinha falado q era reciclagem de membrana tá com cara de ser retículo...) , etc. e os grânulos? OITO tipos diferentes... e o autor hipotetiza queestes diferentes tipos de hemócitos podem ser diferentes estágios de uma via de maturação destas células, ou que simplesmente são mudanças súbitas individuais - sem via nenhuma. Já os OITO tipos de grânulos, ele diz que não está claro do porquê desta diversidade, mas que é frequentemente encontrado em outros bivalves. E pode ser que cada tipo de grânulo seja especializado em uma específica via de defesa na célula.

Mas eu acho que o técnico lá da uerj tava com razão...ficou pouco contrastado, em comparação com as microfotos do artigo

That´s all, folks!










































































sexta-feira, 14 de março de 2008

"O" artigo



Algumas semanas atrás fui no MET da uerj com a Silvana e a Cíntia para finalmente ver nosso material – os meus hemócitos da C. rhizophorae e os hemócitos da ascídia da Cíntia.
Quando os chefes me disseram que eu teria que fazer ME, e ainda por cima de transmissão, quase chorei, pq o-di-a-va essa metodologia (trauma de biogeral), que pra mim nada mais era um monte de borrão (ô despeito...). mas confesso: quando vi minhas imagens, quase chorei, sim, mas de emoção, porque eram L-I-N-D-A-S. Td bem que ñ entendia patavinas (só sabia diferenciar o núcleo do citoplasma), mas isso é questão de olho, de prática.








Muito bem, então a Cíntia me pediu pra procurar artigos que falavam de MET de hemócitos. Pensei “ah, deve ter de montes, especialmente de C. virginica e C. gigas, mesmo gênero que a minha rhizophorae, pois lá na Europa eles estudam bastante essas duas, e Mytilus edulis também, pois lá eles cultivam para consumo, estudam parasitas, efeitos de metais pesados e outras substâncias, expressão gênica etc etc.” qual não foi minha surpresa, ao procurar no web of science e no science direct, apareceram pouquíssimos artigos. Tentei várias palavras-chave, TEM (a tonta tinha tentado MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão, em português, achou nadinha, só o particípio do verbo meet – met rs. O certo é Transmission Electron Microscopy, TEM), haemolymph, haemocytes, crassostrea, bivalves, todas estas palavras combinadas entre si. Nada significativo.




Até que... a Ju, minha grande amiga do lab, que divide comigo o aconchegante cafofo da 32 no underground do fundão... me passa o artigo mágico e salvador:







Sim, Saccostrea glomerata (abaixo), uma ostra que tem só lá na Austrália. Provavelmente não deve ser mais relacionada com a C. rhizophorae que as espécies do mesmo gênero, mas já é um começo (fico devendo para próximos posts uma pesquisa filogenética de ostras, pois acho interessantíssimo levar isso em conta em se tratando de comparar hemócitos, algo que até hj ñ vi em nenhum artigo. Que achas, Mauro e Sil? No início da facul ñ gostava, ou melhor, não entendia muito sobre, mas agora...hehe). E o trabalho é bom, eles fazem muitas coisas que vou explicar melhor no próximo post (estou preparando uma resenha do artigo). Até estava comentando com o Pablito, que o trabalho não é conclusivo, mas abre uma gama de possibilidades e boas idéias. E ele é novíssimo, saiu no início do ano passado.


E é claro, malandramente, até antes mesmo de destrinchar o artigo, corri lá para as referências atrás de outros artigos. Uns muito interessantes. Mas o que falava de caracterização de hemócitos de C. virginica, advinha: ñ tá disponível na web, e a revista tem só lá no Museu Nacional...Já acionei os meus contatos de lá pra ñ ter que me despencar até São Cristóvão. Sempre quando o artigo é aquele que queremos, aquele que vai clarear as idéias, propor uma nova metodologia que dará certo...ele não está disponível :(

Enfim, se não surgir nenhum outro artigo “bombástico”, será este que irei apresentar no meu seminário.





segunda-feira, 10 de março de 2008

Á Nossa Senhora Destrancadora de Teses contra o “Exu Tranca Tese”

essa novena está pregada no mural lá do lab. achei por bem disponibilizá-la aqui e compartilhá-la com meus queridos leitores:

Á Nossa Senhora Destrancadora de Teses contra o “Exu Tranca Tese”

* Novena para aqueles que foram vítimas de alguma das artimanhas do “Exu Tranca Tese” ou para aqueles que querem proteção contra essa entidade:

N. Senhora Destrancadora das Teses, em ti confiamos para a proteção conta o Exu Tranca Teses, nos proteja de: queimação de pen drive, bibliografia em alemão, visita fora de hora, linha no Word que não sobe com o “Del”, fotocopiadora quebrada. Dá-me: encontros com orientador no corredor da universidade e livro emprestado com data de devolução para 2050.

Ah, Senhora, livra-me também das perguntas indiscretas, das dúvidas fora de hora, e das incertezas idem. Ajuda-me a lembrar dos nomes dos autores e da pronúncia deles, assim como do modo como se faz a notação de revistas. Nossa senhora, livra-me de pensamentos acerca de minha teses durante meu sono. Que eu possa dormir o sono dos justos impunemente, sem que tenha que me levantar ou acender a luz para anotar insights invasivos que detonam minha mente quando precisa descansar para mais um dia de batalha! Que tais pensamentos venham na hora certa, quando me sento diante do meu pc e eu não me torne um zumbi.

Ó Senhora, desperta no meu orientador uma enorme vontade de ler minha tese. Que ele a leia com olhos vigilantes, para não deixar passar nenhuma monstruosidade, mas também com olhos piedosos, para me deixar ir enfrentar a banca. E que a banca, Senhora, me dê os apertos que achar necessários, mas que ao final assine a poderosa ata, redenção final dos meus inúmeros pecados. Nossa Senhora, meu orientador insiste em me dizer que a minha tese está, entre aspas, uma merda, mas eu sinto que a Senhora vai me dar uma luz bem forte e lançar como um passe de mágica, artigos que abram meu cérebro tão debilitado por tamanha pressão.

Minha santa querida, já que eu fiz esta escolha na minha vida e sinto na obrigação de terminar, me dá forças para não matar um!
AMÉM!

sábado, 8 de março de 2008

O início...

Olá caros leitores.
Fiz esse blog sob fortíssima recomendação do meu querido e amado orientador, com o objetivo de treinar e desenvolver a escrita científica. Escrever não é fácil para a maioria dos brasileiros. Expressar e defender suas idéias, usando argumentos consistentes é o terror de qualquer iniciante (ou até mesmo veterano) na carreira científica.
Gosto de escrever. Escrevo bem, sem falsa modéstia; escrevo bem porque leio muito – td bem q depois q entrei na facul a quantidade de leituras caiu um pouco. Mas mesmo lendo muito, só se escreve bem...escrevendo. é treino. (Até hj lembro do meu prof d redação no cursinho me dizendo isso: “redação é técnica, não é inspiração”). Digo que escrevo bem, mas textos comuns, “não- científicos” – historinhas, contos, etc. Sempre tive essa inquietude de passar para o papel – ops, computador – histórias, conflitos, personagens etc. Ah, se vida de escritor fosse mais fácil... Claro que isso contribui para qualquer tipo de escrita, especialmente falando em gramática e ortografia (fico abismada com certos erros de ortografia, mas td bem), mas toda “modalidade” de escrita exige treino. Aqui no blog vou tentar treinar um pouco mais – já que relatório do estágio é somente 1x ao ano :D – mas além disso, organizar as idéias e analisar os resultados do trabalho q faço, tanto no lab do mauro quanto da silvana. Mais importante que escrever, é ter idéias e argumentos bons. De início não me prendo à escrita “certinha”: primeiro tem que organizar as coisas pra depois pôr a roupagem bonita rs.

Agora, o porquê do nome: sexta feira, o mauro me convidou para assistir a (mais) uma oficina da Sônia Rodrigues sobre linguagem, que rolou no final de um curso de EAD,. É óbvio que fui assistir. E um dos pontos da oficina é mostrar a diferença de descrição e análise. Se vc lê em um texto que joão bateu em maria, você pode afirmar que joão agrediu maria, mas não pode falar que joão o fez porque estava com raiva dela por tê-lo traído (a não ser que esteja escrito, claro rs). E em um dos exercícios que a Sônia fez nesta oficina, ela falou: “primeiro temos que observar e descrever, para só depois analisar”. Achei marcante, expressa bem a nossa arte de sermos cientistas. É a premissa básica.