Mais um erro que vira acerto

Quinta feira a Ingrid ia contar uma placa - desta vez usando o L15 com HEPES e no dia seguinte, Só que quando cheguei no lab, voltando do CAp, vi que ela tinha esquecido de retirar o VN e adicionar o L-15 para só depois contar. Tudo bem, falhas acontecem, e ainda perguntei se ela conseguiu contar com o VN lá. E sim, é possível contar com o VN no poço! Eu tirava porque no início dos meus experimentos com este corante percebia que as céls estavam ficando ruins por causa do corante, mas agora relembrando com meus botões percebo que as céls já não estavam muito boas. Agora está resolvido uma das diferenças do meu protocolo de VN para o do Moore e cia.

Como montar um experimento???

Dúvidas ó dúvidas...

Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.

Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.

Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!

Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?

Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.

E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...

Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)

Quantas dúvidas, quantas idéias...

Aventuras em Angra dos Reis

Na sexta última (1), fomos eu e Ju para Angra enfrentar os coquilles (Nodipecten nososus, família Pectinidade). Eu, especialista em puncionar hemolinfa do músculo, fui junto para fazer o trabalho e ajudar a Ju no mestrado dela. E ela retirou as brânquias, glândula digestiva e músculo (e que músculo!)

Depois de 2h e meia na kombi barulhenta e sacolejante, após diversas retenções por conta das obras de duplicação de pista e reforma dos 2 túneis que vão para a costa verde, chegamos ao projeto POMAR, onde a Petrobrás instalou um centro de cultivo de sementes (bivalves jovens). O dia estava lindo e tínhamos a vista para o mar. Esperamos o Petrus achar o contado dele e, de cara com os coquiles, começamos nosso trabalho. Gastei uns dois coquiles para achar a posição correta de furar (não era tão difícil assim como pensei). O músculo do bicho é enorme, e bem forte, pensei que ia tirar litros de hemolinfa. Que engano... o máximo que consegui tirar foi 1 mL, e muitas vezes cheio de pedaços de tecido, que analisando depois eram ora pedaços do manto (parte mole do bicho que fica preso mais externamente à concha, na beiradinha) ora da brânquia, que rodeava um pouco o músculo e era de cor alaranjada. Mas a melhor (ou pior) parte foi "judiar" do bichinho. Eu distraída e o Petrus chamou a atenção de que o coquiles, mesmo depois de ter as valvas (cada metade da concha é chamada de valva) separadas, ele continuava contraindo o músculo como se fosse para fechar as valvas. Ao estimular o manto ou o próprio músculo, este se contraía e o manto também mexia! A Ju ficou morrendo de pena, repetiu diversas vezes que ela não ia para o céu, disse"tadinho!" umas cem vezes e eu, sádica, cutucando o bicho. Até que um parente dele se vingou com um golpe de mestre: gentilmente "se abriu" para eu espetar o músculo com a seringa e enquanto fazia força para puxar o êmbolo Plof! Ele dá uma contração com toda a força! Quase que meu dedo vai, quase que me espeto com a agulha. Xinguei o bicho, e como xinguei. Tive que apertar as duas valvas para que não ocorresse de novo.

Imagem do coquiles aberto. A parte branca na imagem é o músculo que fecha as valvas; a parte laranja são as brânquias.

Eu e a Ju abrimos mão do nosso almoço (o Petrus e o Carlos, que nos levou até lá almoçaram enquanto trabalhávamos) para voltarmos logo na sacolejante e barulhenta kombi, percorrendo as sinuosas pistas daquela região. Não me aguentei: dormi em cima da minha mochila e só acordei já na Av. Brasil. Pensava que a hemolinfa não tinha sido suficiente, que a Ju não conseguiria extrair quase nada de RNA... e qual não foi nossa surpresa, ao chegarmos no lab, que havia uma "maçaroca" branca decantada no falcon! Isto muito provável é sinal de hemócitos, e a Ju havia me falado antes que aconteceu o mesmo com os hemócitos das ascídias da Cíntia, de tanta célula que havia.

Como já estávamos enjoadas de carro, era sexta feira e nem brincando queríamos pegar a Av. Brasil, fomos embora de barca. Melhor balançar de outro jeito...

Ah, mais algumas informações sobre o projeto e o coquilles, clique aqui.