Meu vermelho neutro continua não dando muito certo...apesar de as células do controle estarem muito melhores, as células tratadas com cádmio não estão como deveriam.
Pesquisando nos artigos sinto que o que estou fazendo não é o correto, não é o que os artigos dizem. até porque sigo um protocolo diferente: nos artigo, é assim: eles extraem a hemolinfa, os hemócitos aderem e depois adiciona-se 40uL do vermelho neutro, e a cada 15 min mais ou menos contam (ou "correm" a lâmina, segundo a Iara me disse) para ver até quanto tempo depois 50% das céls estão coradas. Já eu faço minha cultura de células em placas, e logicamente tive que adaptar o protocolo. Eu deixo o corante em contato com as céls por 5 min, descarto e conto as células coradas.
Conversando com a Ju, concluímos que o tempo que deixo exposto é muito pouco para observar o corante na cél, ou seja, muito pouco tempo para ver cél corada. Explico. Vamos tomar o tempo de 180 min como o tempo para que haja 50% da céls coradas. Este é o tempo que as céls saldáveis levam para 50% do total fiquem coradas. Já em uma célula estressada, este tempo cai para 20 min. Ou seja, somente após 20 min é que há 50% das céls coradas com o VN. Conclusão: o tempo que estou fazendo, 5 min, não é suficiente para que o corante extravase do lisossomo para o citoplasma!
Então a ju sugeriu de fazer mais próximo do que os artigos dizem, e diminuir a concentração tb. Só que tem um porém: eles contam a mesma lâmina o tempo inteiro, e não tem como eu fazer contar cada poço 4x em tempos diferentes. Portanto, talvez seria interessante fazer cada coluna (com poços de concentrações diferentes) um tempo. Mas... será que as céls são diferentes, mesmo sendo da mesma ostra?
Outra coisa que eu gostaria de fazer era um gráfico comparando VN e TRipan, pois pensamos que as céls a 2uM não coraram por estarem mortas, hipótese refutada pelo azul de tripan. Então, teria que, após o VN, colocar o tripan e contar as céls coradas, só que: 1)ao final de contar 1 placa inteira as céls podem mortas pela ação do VN, que mesmo sendo um corante vital tem sua toxicidade; 2) após adicionar e retirar líquidos (L15, VN, L15) dos poços, as próprias céls se soltam, umas mortas e outras não, restando um número muito menor do que o inicial.
E se fiséssemos outra placa só para o Tripan? Mais um problema: seria outro experimento, com outras céls...
Mais uma idéia maluca: Por que não pegar o L15 do poço, colocar em outro e estimar a quantidade, ver VN e Tripan? Teve uma vez que fiz isso (retirar as céls e adicionar em novo poço) , e vi que algumas céls aderiam! Bom, isto faz muito tempo, e também acho que na verdade não eram hemócitos mas céls de algum parasita (no início do estágio eu tinha muito problema com estas céls estranhas)
Quantas dúvidas, quantas idéias...
Um comentário:
Nós já não tinhamos discutido todas essas hipóteses?
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