The PCR song

A Ju me passou esse vídeo. Lembrei que no PRIMO14 a gente - digo, eles - cantaram uma musiquinha neste estilo e foi muuuuuito engraçado...

vídeo aqui

Se vc é ruim de inglês que nem eu e entendeu nada, aí vai a letra desta música do vídeo para meus queridos leitores cantarem junto...
Em homenagem à Ju e à Andreza (que deixou nosso cafofo), que sofriam com os PCRs q ñ davam certo...

There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.
(Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.
Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases too.
Denaturing, annealing, and extending,
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.

[Chorus]
PCR when you need to detect mutation (detect mutation)
PCR when you need to recombine (recombine)
PCR when you need to find out who the daddy is (who’s your daddy?)
PCR when you need to solve a crime (solve a crime)
(2x)

Meu primeiro vídeo!

ô mauro...lembra destas fotos? agora virou vídeo... parece aqueles videozinhos de céls q tem no CD do the cell, mas esse é muito mais legal..acho que vou levar um laptop pro congresso pra mostrar lá! Vai ser sucesso!!! no ciência viva então...a Eleonora ia amar! rs

Hein... e imagina os vídeos que daria pra fazer com aquele tal "time-lapse photomicrography do artigo... ops, ainda ñ postei ele!

A magia de ser cientista

Toda profissão tem seus vieses. Mas também suas alegrias. E não falo somente de ir a congressos, visitar labs fora da UFRJ (ou até mesmo dentro), fazer churrasco (ou ir à CADEG!!!!) no fim do ano.

Desde que entrei no estágio no radioiso venho tentando fazer uma cultura primária dos hemócitos. Procurei protocolos, testei, adaptei, e nada. Me perguntava (e até hoje me pergunto) "como eles fizeram para conseguir x% de céls viáveis?!" Mas eu não me dei por vencida.
Desconfiada que a centrifugação estivesse estressando demais as células (sem falar que são 10 min de centrifugação, depois ressuspende, etc), tirei hemolinfa (hl) e plaqueei direto. Sem centrifugar. Sem anti-coagulante. Pá-pum, simples assim. Geladeira (isso é assunto pra mais tarde). 24h depois e voilà! céls aderidas! céls não coradas de Trypan! Eu! Eu!Eu! Eu que fiz!!!

E essa semana, mais uma alegria ao sabor "eu que fiz" (made by Americo&Figueiredo). A ju não tava conseguindo extrair RNA da hl de jeito nenhum. Brânquia e Gl. digestiva, blz, tudo bonitinho. Já na hl...as razões lá que tem q dar no nanodrop tudo ruim, a quantidade era muuuito pouquinha... por ex, a razão RNA/ptn tem q tá em torno de 2 - o q significa que tem nenhuma ptn, pois o processo de extração separa o RNA do resto (ptn, carboidrato, lipídio). se tiver baixa, é pq tinha mt proteína. Tava dando 2,8 (o q significa? mt pouco RNA e mt ptn?)
E pensando, e pesquisando, sugeri: "centrifuga". Acho que fizemos isso 1 tempo atrás, com 1 ostra só. Desta vez tirei hl d umas 4 ostras, que deu no total 9 mL. Pellet buniiiiiiiiiiiito!!!! Faz o protocolo, tal tal... voilà!!!! melhorou!!!! RNA em excelentíssima quantidade, razão RNA/ptn ok...

mas nem td tava perfeito... a razão das absorbâncias 260/230 nm deu abaixo do ideal, o q siginifica que pode ter sido contaminação por trizol, etanol polissacarídeos, outros compostos compostos orgânicos, mts outras coisas. Então ela fez umas modificações no protocolo pra ver se dar pra melhorar essa razão. Mas mesmo que não der, fico feliz por já termos conseguido modificar as outras 2 variáveis q ñ estavam dando certo.

Mas o resultado só saberemos na segunda. sabe como é repartição pública, ponto facultativo...

Sydney rock oyster (Saccostrea glomerata) hemocytes: Morphology and function

Bom, como prometido, um apanhado desse artigo. Gostei dele pq ele fala sobre muitas das minhas dúvidas.
OBJETIVO: S. glomerata é uma das espécies mais importantes cultivadas em aquacultura, e é atacada por uma variedade de doenças infecciosas e infestação de parasitas. E os hemócitos participam de importantes vias de respostas imunes contra estes agentes infecciosos. Além disso, o estresse ambiental nas suscetibilidade e influência nas respostas imunológicas dos hemócitos contra tais os agentes. Sabe-se que temperatura, salinidade e poluentes químicos alteram as atividades dos hemócitos, e estes fatores podem aumentar a suscetibilidade das ostras a infecções. (TRADUÇÃO LIVRE DO ARTIGO)

Na literatura, é muito controversa a classificação dos hemócitos - pra invertebrado td é mais difícil. Mas é concenso que há pelo menos dois tipos padrão: os granulócitos - que possuem grânulos no citoplasma - e hialinócitos - que não os possuem, ou em quantidade muito reduzida. E dentro desss dois tipos é que as classificações podem variar, de acordo com a técnica empregada. neste artigo o autor usou algumas técnicas para criar classificações, baseada na morfologia (em microscopia de luz, de transmissão, de varredura) acido- ou basofilicidade dos grânulos ou citoplasma, tamanho e quantidade de grânulos, etc.

* Para caracterização, ele lançou mão das seguintes técnicas:

1) Separação dos hemócitos por M.O. (contraste de fase interferencial; “time-lapse photophotomicroscopy, que deve ser um aparelho fodástico, que ele tira fotos a cada 5s.)

2) coloração Giemsa/ May-grünwald

3) citometria de fluxo (site óootemo que achei pois ficava quebrando a cabeça de como o citômetro dava o tam. e a quantidade de grânulos nas células)

4) TEM (transmition electron microscopy)
5) SEM (scanning electron microscopy)

* além da caracterização morfológica, o autor também verificou a atividade fagocítica dos hemócitos, empregando os seguintes métodos:

- Imunohistoquímica para detecção de:

1) fosfatase ácida
2) peroxidase
3) fenoloxidase
4) superoxido
5) melanina

* Segundo o artigo, estas substâncias quando presentes no hemócito indicam se ocorre alguma atividade fagocítica. Peroxidade e fenoloxidade, por exemplo, estão presentes nos lisossomos, ou seja, atua como enzimas digestivas.

- Atividade fagocítica:

1) com S. cerevisae corado com vermelho congo

2) encapsulação com hifa de fungo

RESULTADOS

* para microscopia de luz:

Figura 1: Hemócitos em microscopia de luz e C de fase interferencial. Em A, temos a hemoblasto-like. Em B, hialinócito. Em C, granulócito. Em G, um agregado de cél, que graças a Deus ñ tenho visto muito nestas placas que ando fazendo, pois antes tinha muuuito deste tipo. quando tem, são de poucas células. em H, granulócito degranulado.

Abaixo, uma tabela resumida com as características que ele deu para cada cél:

Tabela 1: resumo da microscopia de luz

Graças ao aparelho que tira foto a cada 5s, eles verificaram que quem inicia a formação destes agregados são os hialinócitos, formando agregados pequenos, que aumentam de tamanho, e então "chama junto" os granulócitos, que começam a degranular!!! Logo pensaria: "ah, então os que se acham que é hialinócitos nada mais são que os granulócitos s/ grânulos..." nãaaao! eles viram q são hialinócitos sim. E como degranula? Os granulócitos formam vacúolos e encaminham seus grânulos para dentro destes vacúolos. E em alguns minutos tudo desaparece misteriosamente....rs


A Barracco já havia me falado que o granulócito de C. rhizophorae degranula. Eu também suspeito que uns pontinhos bem pequenininhos que vejo nas minhas placas sejam grânulos dos granulócitos. Mas uma foto tão bacana quanto a H...

Outra coisa que me surpreendeu: granulócito com auto-fluorescência em UV (figuras E e F)! Vai, por essa vc ñ esperava, ñ é?

Figura 2: Granulócitos sob luz UV

* Para citometria de fluxo:

Sobre citometria de fluxo, ele utilizou 5 individuos. Encontrou uma variabildade alta, mas pôde-se distinguiur basicamente 4 populações.
Em algumas ostras foram encontrados apenas R1 e R2, enquanto que em outras, foram encontrados todas as subpopulações. Ao observarem no microscópio, confirmou-se que R1 são granulócitos e R2, hialinócitos. Já R3 e R4 não puderam ser eficientemente classificados devido ao baixo número de células por região.

Abaixo, um resumo:

Tabela 2: Diferentes subpopulações de hemócitos classificados por citometria de fluxo

* Para Imunocitoquímica:

baixo, uma tabelinha resumida. As fotos estão bem bacanas, mas não vou adicioná-las aqui pois vai ficar imenso o post.

Tabela 3: Imunohistoquímica

Ou seja, todas as imunos deram positivas para todas as substâncias em granulócitos. Como eles fagocitam mais ativamente, há maior produção destas enzimas (fosfatase ácida, peroxidase, fenoloxidade) além de superóxido e melanina, todos envolvidos em processos de degração de corpos estranhos fagocitados por eles. Provavelmente por fagocitar menos, hialinócito deve não produzir, ou melhor, produzir quantidades muito pequenas destas enzimas.

FAGOCITANDO...

O autor viu que tanto granulócitos quanto hialinócitos tem habilidade de fagocitar, neste experimento ele utilizou o fungo C. cerevisae (péssimas lembranças...rs), sendo os granulócitos mais eficientes - teve um lá que fagocitou até 30 céls! Uma diferença interessante: os granulócitos não emitem filopódios para fagocitar ( ou então filopódios muito curtos): eles "engolfam" (verbo do artigo - engulfed) por invaginação da membrana. Já os hialinócitos emitem looongos filopódios.

Os granulócitos também encapsulam hifas (este processo ocorre qd a partícula estranha é mt maior que a célula). Alguns granulócitos ficaram em torno da hifa, e antes mesmo de ter algum contato, alguns degranularam. e no final de 40min, todos q estaavam participando do processo degranularam. No entanto, os hialinócitos pouco participaram deste processo. E também fizeram uma coloração para verificar a melanização destas cápsulas. Após uma pesquisa rápida no Oráculo - em fontes confiáveis, claro), a melanização ocorre após a ativação da cascata de fenoloxidase (PO), e este processo é uma resposta do sistema imune que também ocorre em vários outros invertebrados.

* Para TEM

Agora vamos p/ parte que interessa. Na TEM, ele divide os hemócitos em váaarios subtipos (4 sub- p/ hialinócitos e 5 sub- p/ granulócitos) baseados na razão citoplasma:núcleo (C:N), formato do núcleo, se forma ou não filopódio, se tem retículo (aliás aquelas "minhoquinhas" q a cíntia tinha falado q era reciclagem de membrana tá com cara de ser retículo...) , etc. e os grânulos? OITO tipos diferentes... e o autor hipotetiza queestes diferentes tipos de hemócitos podem ser diferentes estágios de uma via de maturação destas células, ou que simplesmente são mudanças súbitas individuais - sem via nenhuma. Já os OITO tipos de grânulos, ele diz que não está claro do porquê desta diversidade, mas que é frequentemente encontrado em outros bivalves. E pode ser que cada tipo de grânulo seja especializado em uma específica via de defesa na célula.

Mas eu acho que o técnico lá da uerj tava com razão...ficou pouco contrastado, em comparação com as microfotos do artigo

That´s all, folks!

"O" artigo

Algumas semanas atrás fui no MET da uerj com a Silvana e a Cíntia para finalmente ver nosso material – os meus hemócitos da C. rhizophorae e os hemócitos da ascídia da Cíntia.
Quando os chefes me disseram que eu teria que fazer ME, e ainda por cima de transmissão, quase chorei, pq o-di-a-va essa metodologia (trauma de biogeral), que pra mim nada mais era um monte de borrão (ô despeito...). mas confesso: quando vi minhas imagens, quase chorei, sim, mas de emoção, porque eram L-I-N-D-A-S. Td bem que ñ entendia patavinas (só sabia diferenciar o núcleo do citoplasma), mas isso é questão de olho, de prática.

Muito bem, então a Cíntia me pediu pra procurar artigos que falavam de MET de hemócitos. Pensei “ah, deve ter de montes, especialmente de C. virginica e C. gigas, mesmo gênero que a minha rhizophorae, pois lá na Europa eles estudam bastante essas duas, e Mytilus edulis também, pois lá eles cultivam para consumo, estudam parasitas, efeitos de metais pesados e outras substâncias, expressão gênica etc etc.” qual não foi minha surpresa, ao procurar no web of science e no science direct, apareceram pouquíssimos artigos. Tentei várias palavras-chave, TEM (a tonta tinha tentado MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão, em português, achou nadinha, só o particípio do verbo meet – met rs. O certo é Transmission Electron Microscopy, TEM), haemolymph, haemocytes, crassostrea, bivalves, todas estas palavras combinadas entre si. Nada significativo.

Até que... a Ju, minha grande amiga do lab, que divide comigo o aconchegante cafofo da 32 no underground do fundão... me passa o artigo mágico e salvador:

Sim, Saccostrea glomerata (abaixo), uma ostra que tem só lá na Austrália. Provavelmente não deve ser mais relacionada com a C. rhizophorae que as espécies do mesmo gênero, mas já é um começo (fico devendo para próximos posts uma pesquisa filogenética de ostras, pois acho interessantíssimo levar isso em conta em se tratando de comparar hemócitos, algo que até hj ñ vi em nenhum artigo. Que achas, Mauro e Sil? No início da facul ñ gostava, ou melhor, não entendia muito sobre, mas agora...hehe). E o trabalho é bom, eles fazem muitas coisas que vou explicar melhor no próximo post (estou preparando uma resenha do artigo). Até estava comentando com o Pablito, que o trabalho não é conclusivo, mas abre uma gama de possibilidades e boas idéias. E ele é novíssimo, saiu no início do ano passado.

E é claro, malandramente, até antes mesmo de destrinchar o artigo, corri lá para as referências atrás de outros artigos. Uns muito interessantes. Mas o que falava de caracterização de hemócitos de C. virginica, advinha: ñ tá disponível na web, e a revista tem só lá no Museu Nacional...Já acionei os meus contatos de lá pra ñ ter que me despencar até São Cristóvão. Sempre quando o artigo é aquele que queremos, aquele que vai clarear as idéias, propor uma nova metodologia que dará certo...ele não está disponível :(

Enfim, se não surgir nenhum outro artigo “bombástico”, será este que irei apresentar no meu seminário.

Á Nossa Senhora Destrancadora de Teses contra o “Exu Tranca Tese”

essa novena está pregada no mural lá do lab. achei por bem disponibilizá-la aqui e compartilhá-la com meus queridos leitores:

Á Nossa Senhora Destrancadora de Teses contra o “Exu Tranca Tese”

* Novena para aqueles que foram vítimas de alguma das artimanhas do “Exu Tranca Tese” ou para aqueles que querem proteção contra essa entidade:

N. Senhora Destrancadora das Teses, em ti confiamos para a proteção conta o Exu Tranca Teses, nos proteja de: queimação de pen drive, bibliografia em alemão, visita fora de hora, linha no Word que não sobe com o “Del”, fotocopiadora quebrada. Dá-me: encontros com orientador no corredor da universidade e livro emprestado com data de devolução para 2050.

Ah, Senhora, livra-me também das perguntas indiscretas, das dúvidas fora de hora, e das incertezas idem. Ajuda-me a lembrar dos nomes dos autores e da pronúncia deles, assim como do modo como se faz a notação de revistas. Nossa senhora, livra-me de pensamentos acerca de minha teses durante meu sono. Que eu possa dormir o sono dos justos impunemente, sem que tenha que me levantar ou acender a luz para anotar insights invasivos que detonam minha mente quando precisa descansar para mais um dia de batalha! Que tais pensamentos venham na hora certa, quando me sento diante do meu pc e eu não me torne um zumbi.

Ó Senhora, desperta no meu orientador uma enorme vontade de ler minha tese. Que ele a leia com olhos vigilantes, para não deixar passar nenhuma monstruosidade, mas também com olhos piedosos, para me deixar ir enfrentar a banca. E que a banca, Senhora, me dê os apertos que achar necessários, mas que ao final assine a poderosa ata, redenção final dos meus inúmeros pecados. Nossa Senhora, meu orientador insiste em me dizer que a minha tese está, entre aspas, uma merda, mas eu sinto que a Senhora vai me dar uma luz bem forte e lançar como um passe de mágica, artigos que abram meu cérebro tão debilitado por tamanha pressão.

Minha santa querida, já que eu fiz esta escolha na minha vida e sinto na obrigação de terminar, me dá forças para não matar um!
AMÉM!

O início...

Olá caros leitores.
Fiz esse blog sob fortíssima recomendação do meu querido e amado orientador, com o objetivo de treinar e desenvolver a escrita científica. Escrever não é fácil para a maioria dos brasileiros. Expressar e defender suas idéias, usando argumentos consistentes é o terror de qualquer iniciante (ou até mesmo veterano) na carreira científica.
Gosto de escrever. Escrevo bem, sem falsa modéstia; escrevo bem porque leio muito – td bem q depois q entrei na facul a quantidade de leituras caiu um pouco. Mas mesmo lendo muito, só se escreve bem...escrevendo. é treino. (Até hj lembro do meu prof d redação no cursinho me dizendo isso: “redação é técnica, não é inspiração”). Digo que escrevo bem, mas textos comuns, “não- científicos” – historinhas, contos, etc. Sempre tive essa inquietude de passar para o papel – ops, computador – histórias, conflitos, personagens etc. Ah, se vida de escritor fosse mais fácil... Claro que isso contribui para qualquer tipo de escrita, especialmente falando em gramática e ortografia (fico abismada com certos erros de ortografia, mas td bem), mas toda “modalidade” de escrita exige treino. Aqui no blog vou tentar treinar um pouco mais – já que relatório do estágio é somente 1x ao ano :D – mas além disso, organizar as idéias e analisar os resultados do trabalho q faço, tanto no lab do mauro quanto da silvana. Mais importante que escrever, é ter idéias e argumentos bons. De início não me prendo à escrita “certinha”: primeiro tem que organizar as coisas pra depois pôr a roupagem bonita rs.

Agora, o porquê do nome: sexta feira, o mauro me convidou para assistir a (mais) uma oficina da Sônia Rodrigues sobre linguagem, que rolou no final de um curso de EAD,. É óbvio que fui assistir. E um dos pontos da oficina é mostrar a diferença de descrição e análise. Se vc lê em um texto que joão bateu em maria, você pode afirmar que joão agrediu maria, mas não pode falar que joão o fez porque estava com raiva dela por tê-lo traído (a não ser que esteja escrito, claro rs). E em um dos exercícios que a Sônia fez nesta oficina, ela falou: “primeiro temos que observar e descrever, para só depois analisar”. Achei marcante, expressa bem a nossa arte de sermos cientistas. É a premissa básica.