Quando a união não faz a força

Trabalhar com células possui seus percalços, que variam de acordo com cada tipo celular. Os hemócitos não fogem à regra. A Paulinha trabalha com hemócitos de caranguejo, e eu com hemócitos de ostra. E compartilhamos um mesmo problema: a agregação (ou coagulação) destas células. Logo que fazemos a punção dos hemócitos, eles se unem em uma maçaroca de células, com a qual não é possível fazer nada. Um grande empecilho. A Paulinha sofre mais que eu: "meus" hemócitos agregam bem menos que os "dela".
Semana passada passei as células no citômetro de fluxo para tentar identificar as populações de hemócitos, necessária para seguir com meus experimentos. Mas a agregação dos hemócitos foi um problema sério. Isso acontece principalmente porque preciso fazer uma centrifugação a fim de concentrar as células e ressuspendi em um meio de cultura, o L-15.
Resultado. Agregou geral.
Em seguida, testei ressuspender as células em uma solução bem conhecida pelo pessoal que trabalha com hemócitos: o antiagregante,que, como o nome diz, impede a agregação. Bingo! células livres, leves e soltas. Resultado. no citômetro, a identificação das células ficou bem melhor.

Artigos russos

No filme “bonecas Russas”, Xavier reflete que sua vida amorosa se assemelha àquelas bonequinhas típicas da Rússia, as Matrioshkas, onde dentro de cada boneca existe uma menor. A busca de informações nos artigos também segue a lógica da bonecas russas: você acha um artigo com alguma informação do seu interesse, mas este cita outro artigo. Você busca a segunda citação, e este cita um terceiro. E quando você acha que o terceiro é o último...bem, pode existir um quarto, ou não nenhum. Mas o pior é quando a informação que você tanto procurava não está em nenhum daqueles que você procurou.

Eu queria comparar como Cao (2003) preparou uma cultura primária de hemócitos de Mytilus galloprovinciallis. Começou nos materiais e métodos com a indicação “segundo Barcia et al. 1999” e fez uma descrição rápida dos procedimentos. Segui esta referência, que me levou ao Hughes et al. (1990) que citava mais um autor cujo trabalho não encontrei nos sites de busca. Em Barcia e Hughes, estava descrito exatamente a mesma preparação que em Cao. Não havia as informações que eu buscava:se as células eram centrifugadas, qual a velocidade e em qual solução seriam ressuspendidas. Em Barcia, há uma centrifugação de 3000 x g com ressuspensão em um tampão para lisar as células. Portanto, esta centrifugação não era para manter as células vivas.

Mas voltando o que me interessou no artigo de Cao. Manter cultura primária de hemócitos (ou melhor, invertebrados como um todo) é muito difícil, principalmente porque não se sabe exatamente quais nutrientes estas células necessitam para sobreviver. Neste artigo, ele consegue manter as células vivas (em torno de 100%), por cerca de 20 dias, o que é um tempo muito bom.

Fig. 1: gráfico de sobrevivência de hemócitos em fungicida (bolinha = 1ug/mL; triângulo: 0,5ug/mL; quadrado: 0,1ug/mL) e em soro fetal bovino (A) e hemolinfa (B)

Neste gráfico, ele analisou o efeito de um fungicida em 3 concentrações diferentes de um fungicida e de duas substâncias que melhoriam a cultura de células: (A) soro fetal bovino – muito usado em culturas de vertebrados por conter diversos componentes (como vitaminas, proteínas, carboidratos, etc) necessários para a sobrevivência das células – e (B) hemolinfa inativada (é como se fizesse um análogo do soro fetal bovino: a hemolinfa foi aquecida, centrifugada e filtrada).
Das três concentrações, a menor concentração do fungicida (0,1µg/mL) apresentou melhor resultado. Com 100% das células viáveis por 20 dias em presença de soro. Quando adicionada a hemolinfa, e esse valor subiu para 25 dias. O curioso é que a concentração de 10 µg/mL é muito comum em culturas de vertebrados, e causa morte de 50% das células após 5 dias de cultura. Por isso que, se trabalhando com invertebrados, sempre temos que adaptar nosso protocolo.
Nas minhas culturas de hemócitos, eu uso uma concentração de 10 µL/mL do antibiótico penicilina-estreptomicina e não utilizo soro nem hemolinfa para complementar o meio de cultura. E olha que esta concentração já foi mais alta, de 100 µL/mL, mas diminuí após sugestão de conversar com uma menina que apresentava trabalho em um congresso que fui.
Tudo bem, as células estão vivas. Mas será que estão saudáveis? Para mim que trabalho com ensaios de toxicologia, até que ponto determinado efeito é causado por um poluente e não pelo fato de as células estarem débeis (doentes)? Por isso que existem diversos ensaios para conferir a “saúde” das células, como a fagocitose, uso de diversos corantes (como o meu vermelho neutro) entre outros. No artigo, ele utilizou como ensaio a quantificação de uma proteína que é envolvida na fagocitose. Então, ele determinou que 3 dias de cultura seria o ideal para fazer este ensaio. Trocando em miúdos: às vezes, não é de grande valor manter a cultura por longos períodos, se o ensaio, teste, however, o seu objetivo não é eficiente em culturas longas.

Poli-lisina e aderência celular

AS células sempre procuram um substrato para aderir, não costumando ficar em suspensão em uma solução. Este substrato pode ser placas de petri, lâminas, lamínulas... Aliás, a desaderência pode ser até indício de que a célula está entrando em morte celular programada, também conhecida como apoptose.

E alguns tipos celulares são danados para não aderir. Ou melhor, elas ficam aderidas por um (pouco) tempo, de algumas horas, mas se é preciso fazer experimentos com exposição de drogas por períodos muito longos, algo como 24h, 48h, 72h com o passar do tempo o número de células aderidas pode diminuir substancialmente.

Para melhorar esta adesão, existem substâncias que são muito empregadas nos laboratórios, como colágeno e laminina, que são proteínas de matriz extracelular (é o material que fica em volta das células, que mantêm a aderência entre as células, formando tecidos, além de outras funções). Elas em geral atuam por atrações de carga: como o lado externo da célula possui carga líquida positiva, estes compostos possuem carga negativa. Inclusive li um trabalho que comparava qual seria a melhor substância para melhorar a adeão celular. E a campeã foi a poli-D-lisina.

A polilisina é um polímero (por isso o prefixo poli) feito do aminóacido lisina. Em outras palavras, é uma lisina "amarrada" na outra. Se a o grupo carboxila do aminoácido lisina "estiver" (na verdade este conceito é muito complexo para explicar am poucas linhas) na esquerda, teremos a poli-L-lisina. E se "estiver" na direita, teremos poli-D-lisina. Sendo que, na natureza, só encontramos proteínas formadas com aminoácidos na forma L.

Sempre usei poli-L-lisina para melhorar a aderência das minhas células, o que de fato ocorre. Porém lendo um artigo que a Ju me enviou, os autores usaram a versão D, sendo que em todos os artigos já lidos por mim a forma usada era a L. Mais tarde, pesquisando no site da Sigma-Aldrich, uma empresa que vende produtos para laoratório, estava escrito na seção FAQ a diferença: como a forma L é encontrada na natureza, alguns tipos celulares podem digeri-la, através de proteases. Nestes casos, a forma D seria a mais recomendada.

Então veio a pergunta: será que meus hemócitos estariam digerindo a poli-L-lisina? Será que eles secretam proteases? Sim, é possível, já que são células circulantes na hemolinfa, e responsáveis pelas respostas de defesa contra patógenos. Mas para não ficar no "achismo", busquei artigos que tivessem feito algum tipo de reação para proteases. Achei um trabalho que fazia detecção de diversas enzimas, entre elas...proteases.

Outro detalhe: buscando mais informações sobre polilisinas, vejo uma pergunta sobre a poli-L-lisina que uso:

- "A polilisina P8920 (nº do catálogo) pode ser usada para cultura de células?"

- "NÃO (grifo meu), pois ela contém 0,01% de timerosal, que é um conservante. Este produto é indicado para aderência de tecidos em lâminas. Para culturas de células, deve ser usado o produto PXXXX que é similar mas sem o conservante".

Ainda, mas ainda bem que não consegui encomendar a poli-L-lisina...

Happy!!!!

Primeiramente:
Passeeeeeeei no mestrado! Agora serei uma pós-graduanda !!! (só falta fazer a matrícula)

Segundo, este post é para tentar clarear algo que está tirando meu sono há algum tempo: os granulócitos da ostra que trabalho, Crassostrea rhizophorae.
A única caracterização morfológica dos hemócitos foi feito por Tânia Barth sob orientação da Marguerita Barracco, a quem tive o prazer de conhecer e traballhar em seu lab por alguns dias.
Ela fez a microscopia óptica dos hemócitos, corando com o corante Giemsa. Nela, ela achou três tipos de hemócitos: um sem grânulos, (hialino), com pouco citoplasma e núcleo grande. Outro hialino mas com muito citoplasma e núcleo menor. E o granulócito, que contêm grânulos no citoplasma. Só que o que vejo nas minhas células é um granulócito com grânulos bem maiores que os dela. Mas ao procurar imagens dos meus granulócitos, achei céls com grânulos parecidos (veja as fotos abaixo):

Hemócitos de C. rhizophorae. a: granulócito da Barracco; b: granulócito semelhante ao da Barracco e c:granulócito diferente ao da Barracco.

Sobre os hemócitos da figura c, pensei em duas hipóteses:

1) que, na verdade, são células de parasitas (protozoários, amebas, etc);
2) são células do músculo, e não da hemolinfa;

Mas ao ler um artigo que o João me enviou, lá de um pessoal da França, vi que na população de hemócitos pode aumentar a porcentagem de granulócitos. Apesar de ele estar se referindo a experimentos com exposições de xenobióticos em culturas in vitro (provavelmente esse aumento ocorreu devido à morte de hialinócitos), isto me deu uma luz. Os granulócitos podem aumentar de freqüência na hemolinfa! Inclusive eu já vi trabalhos que fizeram contagem diferencial em diferentes estações do ano para quantificar possíveis mudanças. Então pensei em mais uma hipótese:

3) manter as ostras no aquário faz que a população de granulócitos aumente além de mudar a morfologia dos grânulos, fazendo com que fique maiores.

Eu penso que esta seja a mais coente porque: i) não observava este tipo celular logo assim que as ostras chegavam; ii) a Barracco mantinhas as ostras no aquário por no máximo 48h.

Vou buscar artigos que falem sobre estas alterações dos hemócitos em bivalves que estejam sob condições de laboratório em outras espécies, além de verificar isto na próxima chegada de ostras. Aliás, manter este aquário descente está difícil, mas vou conseguir!

Meu primeiro vídeo!

ô mauro...lembra destas fotos? agora virou vídeo... parece aqueles videozinhos de céls q tem no CD do the cell, mas esse é muito mais legal..acho que vou levar um laptop pro congresso pra mostrar lá! Vai ser sucesso!!! no ciência viva então...a Eleonora ia amar! rs

Hein... e imagina os vídeos que daria pra fazer com aquele tal "time-lapse photomicrography do artigo... ops, ainda ñ postei ele!

Sydney rock oyster (Saccostrea glomerata) hemocytes: Morphology and function

Bom, como prometido, um apanhado desse artigo. Gostei dele pq ele fala sobre muitas das minhas dúvidas.
OBJETIVO: S. glomerata é uma das espécies mais importantes cultivadas em aquacultura, e é atacada por uma variedade de doenças infecciosas e infestação de parasitas. E os hemócitos participam de importantes vias de respostas imunes contra estes agentes infecciosos. Além disso, o estresse ambiental nas suscetibilidade e influência nas respostas imunológicas dos hemócitos contra tais os agentes. Sabe-se que temperatura, salinidade e poluentes químicos alteram as atividades dos hemócitos, e estes fatores podem aumentar a suscetibilidade das ostras a infecções. (TRADUÇÃO LIVRE DO ARTIGO)

Na literatura, é muito controversa a classificação dos hemócitos - pra invertebrado td é mais difícil. Mas é concenso que há pelo menos dois tipos padrão: os granulócitos - que possuem grânulos no citoplasma - e hialinócitos - que não os possuem, ou em quantidade muito reduzida. E dentro desss dois tipos é que as classificações podem variar, de acordo com a técnica empregada. neste artigo o autor usou algumas técnicas para criar classificações, baseada na morfologia (em microscopia de luz, de transmissão, de varredura) acido- ou basofilicidade dos grânulos ou citoplasma, tamanho e quantidade de grânulos, etc.

* Para caracterização, ele lançou mão das seguintes técnicas:

1) Separação dos hemócitos por M.O. (contraste de fase interferencial; “time-lapse photophotomicroscopy, que deve ser um aparelho fodástico, que ele tira fotos a cada 5s.)

2) coloração Giemsa/ May-grünwald

3) citometria de fluxo (site óootemo que achei pois ficava quebrando a cabeça de como o citômetro dava o tam. e a quantidade de grânulos nas células)

4) TEM (transmition electron microscopy)
5) SEM (scanning electron microscopy)

* além da caracterização morfológica, o autor também verificou a atividade fagocítica dos hemócitos, empregando os seguintes métodos:

- Imunohistoquímica para detecção de:

1) fosfatase ácida
2) peroxidase
3) fenoloxidase
4) superoxido
5) melanina

* Segundo o artigo, estas substâncias quando presentes no hemócito indicam se ocorre alguma atividade fagocítica. Peroxidade e fenoloxidade, por exemplo, estão presentes nos lisossomos, ou seja, atua como enzimas digestivas.

- Atividade fagocítica:

1) com S. cerevisae corado com vermelho congo

2) encapsulação com hifa de fungo

RESULTADOS

* para microscopia de luz:

Figura 1: Hemócitos em microscopia de luz e C de fase interferencial. Em A, temos a hemoblasto-like. Em B, hialinócito. Em C, granulócito. Em G, um agregado de cél, que graças a Deus ñ tenho visto muito nestas placas que ando fazendo, pois antes tinha muuuito deste tipo. quando tem, são de poucas células. em H, granulócito degranulado.

Abaixo, uma tabela resumida com as características que ele deu para cada cél:

Tabela 1: resumo da microscopia de luz

Graças ao aparelho que tira foto a cada 5s, eles verificaram que quem inicia a formação destes agregados são os hialinócitos, formando agregados pequenos, que aumentam de tamanho, e então "chama junto" os granulócitos, que começam a degranular!!! Logo pensaria: "ah, então os que se acham que é hialinócitos nada mais são que os granulócitos s/ grânulos..." nãaaao! eles viram q são hialinócitos sim. E como degranula? Os granulócitos formam vacúolos e encaminham seus grânulos para dentro destes vacúolos. E em alguns minutos tudo desaparece misteriosamente....rs


A Barracco já havia me falado que o granulócito de C. rhizophorae degranula. Eu também suspeito que uns pontinhos bem pequenininhos que vejo nas minhas placas sejam grânulos dos granulócitos. Mas uma foto tão bacana quanto a H...

Outra coisa que me surpreendeu: granulócito com auto-fluorescência em UV (figuras E e F)! Vai, por essa vc ñ esperava, ñ é?

Figura 2: Granulócitos sob luz UV

* Para citometria de fluxo:

Sobre citometria de fluxo, ele utilizou 5 individuos. Encontrou uma variabildade alta, mas pôde-se distinguiur basicamente 4 populações.
Em algumas ostras foram encontrados apenas R1 e R2, enquanto que em outras, foram encontrados todas as subpopulações. Ao observarem no microscópio, confirmou-se que R1 são granulócitos e R2, hialinócitos. Já R3 e R4 não puderam ser eficientemente classificados devido ao baixo número de células por região.

Abaixo, um resumo:

Tabela 2: Diferentes subpopulações de hemócitos classificados por citometria de fluxo

* Para Imunocitoquímica:

baixo, uma tabelinha resumida. As fotos estão bem bacanas, mas não vou adicioná-las aqui pois vai ficar imenso o post.

Tabela 3: Imunohistoquímica

Ou seja, todas as imunos deram positivas para todas as substâncias em granulócitos. Como eles fagocitam mais ativamente, há maior produção destas enzimas (fosfatase ácida, peroxidase, fenoloxidade) além de superóxido e melanina, todos envolvidos em processos de degração de corpos estranhos fagocitados por eles. Provavelmente por fagocitar menos, hialinócito deve não produzir, ou melhor, produzir quantidades muito pequenas destas enzimas.

FAGOCITANDO...

O autor viu que tanto granulócitos quanto hialinócitos tem habilidade de fagocitar, neste experimento ele utilizou o fungo C. cerevisae (péssimas lembranças...rs), sendo os granulócitos mais eficientes - teve um lá que fagocitou até 30 céls! Uma diferença interessante: os granulócitos não emitem filopódios para fagocitar ( ou então filopódios muito curtos): eles "engolfam" (verbo do artigo - engulfed) por invaginação da membrana. Já os hialinócitos emitem looongos filopódios.

Os granulócitos também encapsulam hifas (este processo ocorre qd a partícula estranha é mt maior que a célula). Alguns granulócitos ficaram em torno da hifa, e antes mesmo de ter algum contato, alguns degranularam. e no final de 40min, todos q estaavam participando do processo degranularam. No entanto, os hialinócitos pouco participaram deste processo. E também fizeram uma coloração para verificar a melanização destas cápsulas. Após uma pesquisa rápida no Oráculo - em fontes confiáveis, claro), a melanização ocorre após a ativação da cascata de fenoloxidase (PO), e este processo é uma resposta do sistema imune que também ocorre em vários outros invertebrados.

* Para TEM

Agora vamos p/ parte que interessa. Na TEM, ele divide os hemócitos em váaarios subtipos (4 sub- p/ hialinócitos e 5 sub- p/ granulócitos) baseados na razão citoplasma:núcleo (C:N), formato do núcleo, se forma ou não filopódio, se tem retículo (aliás aquelas "minhoquinhas" q a cíntia tinha falado q era reciclagem de membrana tá com cara de ser retículo...) , etc. e os grânulos? OITO tipos diferentes... e o autor hipotetiza queestes diferentes tipos de hemócitos podem ser diferentes estágios de uma via de maturação destas células, ou que simplesmente são mudanças súbitas individuais - sem via nenhuma. Já os OITO tipos de grânulos, ele diz que não está claro do porquê desta diversidade, mas que é frequentemente encontrado em outros bivalves. E pode ser que cada tipo de grânulo seja especializado em uma específica via de defesa na célula.

Mas eu acho que o técnico lá da uerj tava com razão...ficou pouco contrastado, em comparação com as microfotos do artigo

That´s all, folks!