As nuances do percoll

Apesar de não usar mais o percoll para separar minhas células, queria deixar um registro da minha experiência com esse reagente.

O percoll é um colóide feito com micropartículas de sílica, recobertas com um polímero, (PVP – polivinilpirrolidona) cuja função é deixar o colóide atóxico para as células. Existem protocolos bem estabelecidos especialmente para separar linfócitos, monócitos ou outras células do sangue.

Muito bem, você decidiu trabalhar com percoll, pois viu um artigo da sua área que utilizava este método de saparação. Com o reagente em mãos, basta diluir para as concentrações do artigo e... nada disso. Primeiro, vá no site do fabricante e faça o download do datasheet (arquivo que contém informações sobre o produto). Você verá que o pH do percoll da garrafinha é 8,9 e a osmolaridade de aproximadamente 32 mOsm! Ou seja, é para matar qualquer célula.

Eu diluía o percoll em uma solução antiagregante (que impede que os hemócitos da ostra agreguem) e pensava que automaticamente o pH e a osmolaridade se ajustassem. Engano meu: continuava básico. Bastava então corrigir o pH com HCl, certo? Só que o HCl faz o percoll virar uma gelatina branca, pois altera a densidade. Mesmo usando um HCl muito diluído, precisaria de um volume grande, o que também alteraria a densidade. Para resolver esse pepino, é preciso diluir o percoll em alguma solução tamponada, ou seja, que possua algum reagente capaz de regular o pH (como o hepes, que é o que uso, ou algum PBS) inicialmente. Como o antiagregante não tem ação tamponante, o pH continuava alto.

Já a osmolaridade é mais complicada, principalmente se você não tem um osmômetro por perto. A saída é fazer diálise (li esse processo em artigos que separavam hemócitos de ascídias), colocando o percoll em uma sacola de plástico semipermeável e deixar agitando overnight na sua solução, com a omolaridade desejada. Porém, há um jeito mais fácil. Basta diluir nove partes de percoll mais uma parte de NaCl a 1,5M. A osmolaridade final fica em torno de 320 mOsm, que é a osmolaridade do meio de cultura que uso (Leibovitz L-15). Queria ter a oportunidade de medir esta diluição final em um osmômetro, só para garantir, mas não conheço ninguém que possua este aparelho lá na faculdade.

Pronto, pH e osmolaridade acertadas, agora é só fazer as diluições necessárias para um gradiente de percoll, contínuo ou descontínuo. E não se esqueça como o percoll de trabalho é 90%, caso você use concentrações em porcentagem.

Segredinho: tive todas essas dicas ao enviar um email para o suporte técnico da Sigma-Aldrich (email em inglês, sure). Eles são fantásticos, sabem muito e são super prestativos. Eu sei que diariamente exercitamos nossa capacidade de raciocínio para solucionar problemas, mas quando trabalhamos com um reagente, kit ou aparelhos novos, além da importância de ler o MANUAL, vale a pena ter contato com o pessoal do suporte técnico, pois no caso dos reagentes, nem todo datasheet é completo. Assim, economizamos tempo precioso e nos dedicamos ao que realmente interessa: nossos experimentos!