sábado, 21 de março de 2009

Poli-lisina e aderência celular

AS células sempre procuram um substrato para aderir, não costumando ficar em suspensão em uma solução. Este substrato pode ser placas de petri, lâminas, lamínulas... Aliás, a desaderência pode ser até indício de que a célula está entrando em morte celular programada, também conhecida como apoptose.

E alguns tipos celulares são danados para não aderir. Ou melhor, elas ficam aderidas por um (pouco) tempo, de algumas horas, mas se é preciso fazer experimentos com exposição de drogas por períodos muito longos, algo como 24h, 48h, 72h com o passar do tempo o número de células aderidas pode diminuir substancialmente.

Para melhorar esta adesão, existem substâncias que são muito empregadas nos laboratórios, como colágeno e laminina, que são proteínas de matriz extracelular (é o material que fica em volta das células, que mantêm a aderência entre as células, formando tecidos, além de outras funções). Elas em geral atuam por atrações de carga: como o lado externo da célula possui carga líquida positiva, estes compostos possuem carga negativa. Inclusive li um trabalho que comparava qual seria a melhor substância para melhorar a adeão celular. E a campeã foi a poli-D-lisina.

A polilisina é um polímero (por isso o prefixo poli) feito do aminóacido lisina. Em outras palavras, é uma lisina "amarrada" na outra. Se a o grupo carboxila do aminoácido lisina "estiver" (na verdade este conceito é muito complexo para explicar am poucas linhas) na esquerda, teremos a poli-L-lisina. E se "estiver" na direita, teremos poli-D-lisina. Sendo que, na natureza, só encontramos proteínas formadas com aminoácidos na forma L.

Sempre usei poli-L-lisina para melhorar a aderência das minhas células, o que de fato ocorre. Porém lendo um artigo que a Ju me enviou, os autores usaram a versão D, sendo que em todos os artigos já lidos por mim a forma usada era a L. Mais tarde, pesquisando no site da Sigma-Aldrich, uma empresa que vende produtos para laoratório, estava escrito na seção FAQ a diferença: como a forma L é encontrada na natureza, alguns tipos celulares podem digeri-la, através de proteases. Nestes casos, a forma D seria a mais recomendada.

Então veio a pergunta: será que meus hemócitos estariam digerindo a poli-L-lisina? Será que eles secretam proteases? Sim, é possível, já que são células circulantes na hemolinfa, e responsáveis pelas respostas de defesa contra patógenos. Mas para não ficar no "achismo", busquei artigos que tivessem feito algum tipo de reação para proteases. Achei um trabalho que fazia detecção de diversas enzimas, entre elas...proteases.

Outro detalhe: buscando mais informações sobre polilisinas, vejo uma pergunta sobre a poli-L-lisina que uso:

- "A polilisina P8920 (nº do catálogo) pode ser usada para cultura de células?"
- "NÃO (grifo meu), pois ela contém 0,01% de timerosal, que é um conservante. Este produto é indicado para aderência de tecidos em lâminas. Para culturas de células, deve ser usado o produto PXXXX que é similar mas sem o conservante".

Ainda, mas ainda bem que não consegui encomendar a poli-L-lisina...

12 comentários:

Juliana Americo disse...

Excelente post. Isso ai, vivendo e aprendendo. Tambem estou aprendendo que ler os FAQs da vida é de grande utilidade.
Sabe que eu vi um protocolo para vermelho neutro colado numa parede aqui e dizia para incubar as cells com vermelho neutro no escuro...nao sei por que, è sensivel a luz?...mas era um protocolo diferente, feito em uma lamina, nao em cultura de cells como vc faz...
Bjs

Fabricio disse...

Pois é, site de fabricante tem informações valiosíssimas! É sempre bom ler tudo o que puder por lá. Eu é que tenho que criar esse hábito hehehe...
Desculpe a ignorância, mas eu achava que a membrana tivesse carga negativa (e a garrafa de cultura, positiva). Se não me engano, a lisina tem carga positiva, ou não?
Bjs =**

Eliane, a Lia disse...

oooops, vc está certo, Fabrício, ato falho. Devia ter olhado com mais calma a fórmula que eu mesma coloquei. Lisina é um dos 3 aminoácidos com carga polar positiv (ou LAH - Lisina, Arginina e Histidina). Dois grupamentos amina, logo a carga líquida é positiva e pH nutro.
Quanto à carga da membrana, vou pesquisar. Se basearmos pela bomba de Na/K, a face citosólica é negativa sim, e a face extracel é positiva (3Na p/fora e 2K p/ dentro). porééeém...existem glicoproteínas de membrana (voltadas p/ a face extracel. que são...carregadas negativamente :)
mas vou corrigir e pesquisar...

Fabricio disse...

Hehehe, gostei do LAH. Agora não esqueço mais! =)
Pela bomba de sódio/potássio, faz todo o sentido. Acho que vc está certa sim. É que quando estudei cultura de células (há uns 3 anos e meio) tinha essa coisa da carga da garrafa ser oposta à da membrana...ou seria da matriz??
ÉEE, lembrei. Acho que a Matriz que é negativa, então a superfície da garrafa seria negativa, pra aumentar a aderência...
Fiquei curioso, vou dar uma pesquisada também hehehe

Mauro Rebelo disse...

O pior é que o Timerosal é dimetilmercúrio! Teoricamente (pq precisa ver a concentração) muito tóxico pras células.

Eliane, a Lia disse...

a concentração do timerosal é de 0,01%.
é verdade, não liguei o nome à coisa. é o mesmo composto utilizado como conservante em vacinas multidoses

Tacito Campois disse...

Qual a melhor forma de preparação da lâmina com a Poli-L-lisina???

Eliane, a Lia disse...

Olá Tacito,
vc pode fazer uma solução de PLL, mergulhar as lâminas e deixar uns 5 ou 10 min e rinsar com água destilada. Vá testando qual o melhor tempo de submersão, ok?
abraços
Eliane

Tacito Campois disse...

Obrigado Eliane, estava deixando 24 horas.. não sei se é necessário deixar tudo isso.. estou diluindo 1:10.. é isso mesmo... e onde é o melhor locar para o armazenamento da PLL preparada? Muito obrigadooo..

Auricélio Macedo disse...

Parabêns pelo post e pela iniciativa. Diferencio macrófagos do sangue periférico para posterior infecção em placas de cultivo. Estava buscando placas que melhorem a aderência celular e cheguei até seu post. Vi que existem placas comerciais de 96 poços tanto com a poli-L-lisina e a poli-D-lisina. Nesse caso, você saberia dizer qual a diferença entre elas e qual a mais indicada? um abraço.

Unknown disse...

Gostei do post Elaine. Fiquei com dúvida em relação ao tipo de produto a ser usado.
Qual a especificação (código PXXXX) da Poli-D-Lisina (ou Poli-L-Lisina) que você menciona não conter Dimerosal? Agradeço a atenção.

Unknown disse...

Uma informação que não ficou muito clara em seu resumo é que a Poli-Lisina aumenta a interação eletrostática entre os íons de carga negativa da membrana celular e os íons de superfície de carga positiva dos fatores de ligação na superfície da cultura. Quando adsorvida na superfície da cultura, aumenta o número de locais com carga positiva disponíveis para ligação celular.