O azul de Tripan... They´re not dead!

Sexta fiz o ensaio do azul de tripan. Apesar de eu ter errado num pequeno detalhe – por causa do sono, cansaço e pressa, falei pra ingrid pôr uma ostra para controle 1, uma ostra para tratado 1, 1 ostra pra ctrl 2 e 1 para tratado 2... porém idéia era justamente o contrário, que cada poço de cada trat e ctrl fosse uma ostra diferente, assim teríamos uma variabilidade biológica (certo Mauro?) O experimento foram oito poços ctrl e oito poços tratado com Cd a 1 uM, sendo que 4 ctrl e 4 tratado seriam só para azul de tripan e os outros 4 ctrl e 4 tratado, para Vermelho neutro e depois, o azul d tripan.

De início comecei pelo VN, mas lá pelo terceiro poço, decidi fazer as linhas só do tripan. Afinal, a nossa hipótese era que o Cd estava matando as céls, e por isso q o VN ñ saía do lisossomo para o citosol, ou pior, talvez sequer estivesse entrando na célula. O resultado é que as céls NÃO coraram com o tripan, ou seja, estavam vivas. E o tratado continuou a não corar também. Levei quase três horas pra contar os poços, e quando voltei aos primeiros poços, o VN estava bem mais forte, claro, com vários lisossomos grandes, quase ocupando todo o espaço do citoplasma. Mas tripan, nada. Somente pouquíssimas céls (4 dentre 250, por exemplo) é que coravam com o Tripan, e mesmo assim não eram as céls q estavam aderidas – havia muitas – mas céls muito pequenas, e só tenho certeza de ser céls pq já li vários artigos falando sobre, e na objetiva de 40x dá pra ver.
Bom, sobre o controle do “somente” tripan, tive outro problema: como esse controle foi feito com uma ostra somente, havia céls estranhas, grandes, com grânulos muito também grandes e amarelados, e que estavam espraiadas antes de adicionar o corante. O curioso é que após adicionar o corante, elas adquiriam a forma arredondada. E tive a impressão que elas espraiaram de novo após retirada do corante. Interessante, mas me serviu de nada pois não corou com tripan, e esqueci de pôr o VN só de curiosidade (a fome tava dilacerante e queria pegar o finzinho do coffee-break do ministro; tadinha, quando cheguei só sobrou um mísero copo de refri). Esse tipo celular me aparecia bastante quando eu tava iniciando as culturas, até já comentei com a Barracco, e provavelmente deve ser algum parasita. Ia tirar foto, mas ALGUÉM desconectou a plaquinha da câmera do laptop, ou pior, tirou o pininho amarelo (que conecta a câmera na placa) da placa. Tentei encaixar mas não ficava, parecia que faltava uma pecinha, que estava quebrada.
Enfim, gostaria de fazer mais uma placa pra ratificar que esse Cd não está atingindo as céls, pelo que parece, já que o ctrl tava bichado. Mas assumindo que isso seja ratificado, agora a questão é? Por quê? O mauro falou que possivelmente as substâncias contidas no meio de cultura estariam quelando o Cd, deixando-o indisponível ao contato com a cél, logo não estaria fazendo “efeito”. Tudo bem, mas isso não justifica que o tratado esteja totalmente livre do corante. Se o Cd está indisponível, ao menos as cels deveriam se parecer com o ctrl, o que não ocorre tanto na coloração do VN quanto na morfologia. (Aliás, a coloração do ctrl é discutível em outro tópico). Eu poderia fazer uns testes aumentando a concentração do Cd, e fazer em paralelo (não por cima) o VN e o tripan.
Outra coisa que me ocorreu é de aquela solução de Cd já estar com “o prazo de validade vencido”; por exemplo, a tampinha do vidro de H2O2 a 10mM já briu sozinha tantas vezes que ali deve ter só água rsrsrs. Lembro de uma conversa com o Rodrigo no avião, voltando de Floripa, ele me dizendo para trocar os reagentes, soluções, etc, fazer tudo novo.
E por falar em soluções, tenho que verificar a salinidade do tripan. Eu fiz a 0,4% em PBS, como tá na literatura, mas salinidade é 1 problema sério para nossas céls, apesar de na sexta não ter visto nada de anormal (a não ser as céls estranhas encolhendo). Talvez eu tenha que fazer um tripan novo, com o PBS ajustado à salinidade.
Outra coisa que me preocupa também é as ostras lá no aquário. Ando muito relapsa, sem verificar a salinidade e pH (apesar de não ver a importância desse parâmetro muito discutido) e TEMPERATURA. Muitas vezes ia pegar umas ostras e a água tava bem quente, principalmente na segunda, após fim de semana. A Ju sugeriu de ela trazer um aquariozinho para colocar umas ostras e deixar na 32, com o ar ligado, pra ver se há alguma diferença, ou fazer isso também quando chegar ostras novas. That´s all, folks!