Artigos russos

No filme “bonecas Russas”, Xavier reflete que sua vida amorosa se assemelha àquelas bonequinhas típicas da Rússia, as Matrioshkas, onde dentro de cada boneca existe uma menor. A busca de informações nos artigos também segue a lógica da bonecas russas: você acha um artigo com alguma informação do seu interesse, mas este cita outro artigo. Você busca a segunda citação, e este cita um terceiro. E quando você acha que o terceiro é o último...bem, pode existir um quarto, ou não nenhum. Mas o pior é quando a informação que você tanto procurava não está em nenhum daqueles que você procurou.

Eu queria comparar como Cao (2003) preparou uma cultura primária de hemócitos de Mytilus galloprovinciallis. Começou nos materiais e métodos com a indicação “segundo Barcia et al. 1999” e fez uma descrição rápida dos procedimentos. Segui esta referência, que me levou ao Hughes et al. (1990) que citava mais um autor cujo trabalho não encontrei nos sites de busca. Em Barcia e Hughes, estava descrito exatamente a mesma preparação que em Cao. Não havia as informações que eu buscava:se as células eram centrifugadas, qual a velocidade e em qual solução seriam ressuspendidas. Em Barcia, há uma centrifugação de 3000 x g com ressuspensão em um tampão para lisar as células. Portanto, esta centrifugação não era para manter as células vivas.

Mas voltando o que me interessou no artigo de Cao. Manter cultura primária de hemócitos (ou melhor, invertebrados como um todo) é muito difícil, principalmente porque não se sabe exatamente quais nutrientes estas células necessitam para sobreviver. Neste artigo, ele consegue manter as células vivas (em torno de 100%), por cerca de 20 dias, o que é um tempo muito bom.

Fig. 1: gráfico de sobrevivência de hemócitos em fungicida (bolinha = 1ug/mL; triângulo: 0,5ug/mL; quadrado: 0,1ug/mL) e em soro fetal bovino (A) e hemolinfa (B)

Neste gráfico, ele analisou o efeito de um fungicida em 3 concentrações diferentes de um fungicida e de duas substâncias que melhoriam a cultura de células: (A) soro fetal bovino – muito usado em culturas de vertebrados por conter diversos componentes (como vitaminas, proteínas, carboidratos, etc) necessários para a sobrevivência das células – e (B) hemolinfa inativada (é como se fizesse um análogo do soro fetal bovino: a hemolinfa foi aquecida, centrifugada e filtrada).
Das três concentrações, a menor concentração do fungicida (0,1µg/mL) apresentou melhor resultado. Com 100% das células viáveis por 20 dias em presença de soro. Quando adicionada a hemolinfa, e esse valor subiu para 25 dias. O curioso é que a concentração de 10 µg/mL é muito comum em culturas de vertebrados, e causa morte de 50% das células após 5 dias de cultura. Por isso que, se trabalhando com invertebrados, sempre temos que adaptar nosso protocolo.
Nas minhas culturas de hemócitos, eu uso uma concentração de 10 µL/mL do antibiótico penicilina-estreptomicina e não utilizo soro nem hemolinfa para complementar o meio de cultura. E olha que esta concentração já foi mais alta, de 100 µL/mL, mas diminuí após sugestão de conversar com uma menina que apresentava trabalho em um congresso que fui.
Tudo bem, as células estão vivas. Mas será que estão saudáveis? Para mim que trabalho com ensaios de toxicologia, até que ponto determinado efeito é causado por um poluente e não pelo fato de as células estarem débeis (doentes)? Por isso que existem diversos ensaios para conferir a “saúde” das células, como a fagocitose, uso de diversos corantes (como o meu vermelho neutro) entre outros. No artigo, ele utilizou como ensaio a quantificação de uma proteína que é envolvida na fagocitose. Então, ele determinou que 3 dias de cultura seria o ideal para fazer este ensaio. Trocando em miúdos: às vezes, não é de grande valor manter a cultura por longos períodos, se o ensaio, teste, however, o seu objetivo não é eficiente em culturas longas.

Quem inventou? - Cultura de tecidos

Enquanto o resultado da seleção para o mestrado não vem, estou escrevendo um artigo sobre culturas primárias solicitado pelo meu orientador. E o assunto deste post é um tópico do meu artigo.

Assim como o Rupert Lee diferenciou “descoberta” de “invenção” em seu livro, farei o mesmo aqui. Este post poderia ser uma continuação do “Quem descobriu?”, mas o que será discutido não será uma descoberta propriamente dita, mas sim uma inventividade.

E o que é uma cultura de tecidos? Simples. A unidade fundamental da vida é a célula. E as células podem formar estruturas altamente organizadas chamadas de tecidos, onde pode prevalecer um tipo celular predominante, como no tecido muscular (e este é dividido em três subtipos, de acordo como o modo que as células se organizam) ou vários tipos celulares, como no tecido sanguíneo, composto por hemácias, linfócitos, monócitos, etc. A cultura de tecidos consiste em obter as células do tecido e mantê-las em um ambiente para que cresçam e proliferem – apesar de nem todos os tipos celulares proliferarem em cultura. A princípio, isto poderia ser feito com células de qualquer tipo de tecido: embrionário, vegetal, nervoso, muscular. Porém como nada é fácil nesta vida de ciência, há muitas dificuldades, principalmente em manter as células vivas e saudáveis.

Ross Harisson

Mas alguém deu o pontapé inicial. E ele se chama Ross Granville Harisson, que em 1907 publicou um trabalho curto, com o objetivo de responder como as fibras nervosas se formavam. Então ele retirou fragmentos de tubo neural de embriões de sapos em lamínulas estéreis. Encobriu os fragmentos de tecido em uma gota de linfa fresca de sapo e emborcou a lamínula com o tecido em uma lâmina que é muito utilizada por microbiologistas para acompanhamento de culturas de bactérias (veja o esquema retirado do site da Corning). Assim, ele pôde acompanhar o desenvolvimento das fibras nervosas do sapo a partir das células que ele explantou.

Técnica da cultura em gota. Coverslip = lamínula; Explant = explante. Lymph= linfa; Glass depression slide = lâmina de vidro com depressão.

Obviamente que antes de Harisson outros pesquisadores tentaram estabelecer culturas de tecidos, porém sem sucesso “completo”, digamos assim. Cada um contribuiu com seus experimentos e discussões. Mas foi o Harisson que teve a “sacação” (será que foi um momento “Eureka”?) de adaptar um material (a lâmina dos microbiologistas) às suas necessidades, além de ser o pioneiro de realizar experimentos com suas células.