Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 5

Finalmente o último dia.

A aula de manhã foi com o Rubem, o coordenador do nosso grupo de seminário. Figuraça. Ele falou de morte celular: apoptose, autofagia e autólise. Muito bom e muito importante pois é um tema que pode cair na prova do mestrado (rs). Ele terminou a aula mais cedo para que pudéssemos nos preparar para o seminário, pois os outros membros do meu grupo tiveram problemas para preparar as partes deles. A Tati, coitada, depois de ter virado a noite preparando a apresentação, ao mesmo tempo que em fazia outras dezenas de coisas, quase surtou quando às 5 da manhã, já com a apresentação pronta, o pc resolveu corromper o arquivo... enfim, ossos do ofício de depender do pc.

Tiramos foto no Castelo - símbolo da Fiocruz - junto com o grupo do curso de biotecnologia. Almocei um queijo quente e partimos para o seminário.

O meu grupo foi o segundo. E de fato fiquei nervosa ao ver que nao era só apresentar o seminário e pronto, ninguém faz perguntas, ou poucas perguntas. Nada. Cada um - Rubem, Moema, Alessandrae Mariana - disse conseiderações. Uma apresentação "tese-like". Eu que fui de vestido, até tirei o casaco na hora da minha parte, pois o calor do nervosismo me tomou rs.

Mas no fim de tudo - e já com o certificado na mão - gostei de ter sido assim. Falei para Moema que foi a primeira vez que me senti na frente de uma banca, mas sem a parte ruim (ter o conceito do trabalho). Todas as colocações foram ótimas (e como o Rubem é chato! rs quero ele na minha banca rs) e estão devidamente anotadas no bloquinho...ah, aquele bloquinho vale ouro!

E mesmo cansada, topei ir ao cinema no Bay Market com a Tati e o Felipe (voltamos de carona com o pai do Felipe), pois merecíamos este agrado!

PS.: Para o leitor atento, que reparou que este post e o anterior tem a data de sábado: na quinta, osite do blogger simplesmente resolveu tirar folga e ontem cheguei cansada, e obviamente despenquei na cama.

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 4

Quinta-feira. Penúltimo dia.

Na parte da manhã tivemos aula com a Alessandra, sobre interação parasita-hospedeiro. Como estava muito cansada de ontem, me dei "ao luxo" de sair da cama um pouquinho mais tarde, até porque já sabia os horários que o Madureira (o ônibus que vai direto para lá e que passa a cada meia hora) passava e também não era um assunto que não me interessava taaanto. Ainda bem que cheguei a tempo de começar a aula, pois, além de a Alessandra dar aula maravilhosamente bem, o assunto foi muito interessante e ela disponibilizou diversos artigos sobre citoesqueleto e de imunologia (especialmente sobre vírus) que sempre são cobrados nos concursos da Fiocruz.

Mas o mais legal foi a técnica que ela mostrou para evidenciar citoesqueleto por...microscpia de varredura! Sim! com o uso de Triton, um detergente, a membrana citoplasmática é degradada e o que sobra é o cito... achei genial, algo que acho que vale a pena eu tentar nas minhas células...

À tarde tivemos microscópio confocal, para vermos nossas lâminas que montamos ontem. Nem preciso dizer que fiquei ba-ban-do com o brinquedinho. lógico que mal encostamos nele - só olhei as células e ajustei o foco. E o programa de imagem, tudo de bom...

Ainda bem que, por sorteio, fomos o primeiro grupo a ver as lâminas, o que significa que saímos mais cedo. O que não significa que cheguei em casa mais cedo, pois o Madureira demorou horrores, ficamos eu e a Tati esperando no ponto, a Av. Brasil parada... E chegar em casa também não significa descansar, pois amanhã é o último dia e o dia da apresentação do seminário. Medo! rs

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 3

Por motivos de força maior, não pude comparecer à parte da manhã, em que a Mariana deu aula sobre endocitose e tráfego de vesículas. Assim como as outras aulas, me disseram que também foi muito bom, mesmo não tendo sobrado uma gota de café no coffee-break (brincadeira, não é porque estava chata, mas neste coffee fizeram só uma garrafa de café, e não duas).

A parte da tarde foi marcada para começar 1:30, para terminar o experimento de ontem e dar termpo de observar no microscópio. Cheguei um pouco em cima da hora, e o meu almoço foi um Chicabon. :) Incubamos as células com faloidina conjugada com TRITC (que NÃO é um anticorpo, é uma droga que faz o papel do AC primário, ligando-se ao citoesqueleto e o TRITC é o fluorocromo), depois com DAPI, lavamos e montamos a lâmina. Quatro horas da tarde e a expectativa de observar se a reação funcionou após o lanchinho...mas...não deu pra ver nada. Não, não é que a reção não tenha dado certo, mas o microscópio de fluorescência não estava legal, a lâmpada tinha desalinhado e o Rubem não estava conseguindo realinhar. Ou seja, meu grupo nem os outros 2 puderam ver coisa nenhuma. Enfim, agora é esperar amanhã anciosamente para olhar as lâminas no...tcham tcham! No confocal!!! uhuuuuu

Agora vou-me pois tenho 2 artiguinhos e umas páginas do Alberts para ler par amanhã...e isso são agora 11 e meia da noite. Viu, isso que dá optar por uma esticadinha e ir ao teatro... :)

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 2

Mais uma vez cheguei calma e tranquilamente na Fiocruz, por volta das 8:30. Dei uma volta em torno do Pavilhão onde o curso estava acontecendo, para explorar novas áreas e descobri uma lanchonete. Órimo, parei para tomar um café e comer um pão para começar o dia bem alimentada.

Hoje a manhã inteira foi com a Moema, sobre motilidade e divisão celular. Muito bom. A parte de divisão celular também foi muito proveitosa, prestei bastante atenção (principalmente porque é tema da minha regência no CAp). E o incrível que o papel do citoesqueleto não é somente na formação do fuso mitótico (que alinha os cromossomos no centro da célula, lembra? Não? Então olhe a foto abaixo), composto por microtúbulos.

O fuso mitótico está em verde: ele é composto por microtúbulos

A dinâmica dos microtúbulos é fascinante: polimeriza, despolimeria, proteínas motoras agindo como carrinhos sobre os microtúbulos, empurra organela pra lá, cromossomo pra cá... actina participando da citocinese, formando o anel que vai separar a célula em duas, associa-se à actinina, que também tem ajuda dos microtúbulos no processo...sem falar os videozinhos que a Moema selecionou, como este abaixo.

http://www.youtube.com/watch?v=CzPGhYiGyZ8

Parte da tarde, fomos ao laboratório fazer experimentos, cujos os resultados iremos apresentar em um seminário ao fim do curso. O meu grupo vai verificar a apoptose em células do timo. Para induzir a poptose, usamos uma droga - a dexametazona, velha conhecida das mamães por ser um composto de vários xaropes. As células já tinham sido incubadas a dexa- por 18h. Hoje fixamos as células, aderimos com poli-L-lisina (velha conhecida minha) e paramos por aí no protocolo pois já era 6 da noite.

A vantagem de as etapas serem longas (fixação,centrifugação, etc etc) é que...fazemos nada nesse meio tempo rs. Quer dizer, foi bom para nos conhecermos mais, interagir, bater papo, perguntar o que cada um faz, os planos de mestrado, e...histórias. Histórias de viagens a congressos, histórias de m... feitas no lab - afinal IC sempre faz m... e, o mais interessante: o Rubem me contou que seria uma opção correr atrás de patrocinadores como a Zeiss para tentar custear minha passagem para Bordeaux. E pensei, é claro, no meu grande amigo Marco Aurélio, que trabalha em uma empresa de materiais para laboratório e com quem praticamente compramos tudo. Será que o meu rostinho e a minha simpatia convencerão a chefia a me patrocinar? Veremos...

Ah, a resposta da pergunta do post anterior não esqueci. Só estou muito cansada, exausta mesmo, para responder hoje ;)

Curso citoesqueleto na Fiocruz - dia 1

Sei que devo os processos da preparação que estou fazendo para microanálise de raios-X, mas os próximos posts serão sobre o curso de citoesqueleto que estou fazendo esta semana na Fiocruz. Este curso a Ju que me indicou, o Mauro e a Silvana acharam ótima idéia, e eu também. Exceto pelo fato de: ter que abrir mão da viagem de Pedologia (matéria compactada de férias, seria minha última eletiva!), ser justo na semana da liga mundial de vôlei (que eu queria ir a todos os 2 jogos do Brasil + semi-final e final, mesmo gastando uma pequena fortuna) e abrir mão de fazer uma barraquinha na festa junina da Biof, em parceria com a Ju, me divertir muito e quem sabe arrecadar uns trocadinhos para o o PRIMO15.

Bom, vamos lá. A Fiocruz é linda, grande, muito aconchegante, nem parece que fica encravada em um bairro onde o "bicho tá comendo", leia-se tiroteio confusão e morte, Manguinhos. Não ficava com medo, até descobrir que a "Faixa de Gaza" (R. Leopoldo Bulhões) fica atrás da Fiocruz. Para dizer a verdade, aquele lugar é outro mundo. (em breve fotos).

Jeito Lia de ser: sempre me perdendo. Achei que a sala fosse no IOC - onde fiz minha inscrição, mas na verdade era no pavilhão ao lado da biblioteca central. E voooolta a Lia tudo de novo, e quem conhece lá sabe que é longinho...mas a amanhã estava agradável, então nada como uma caminhada para acordar.

No pavilhão certo, o curso, marcado para as 9 da manhã, atrasou um pouquinho. Fizeram-se as apresentações, o material (camiseta, pasta, bloquinho, caneta com calendário e apostila) foi distribuído. A 1a parte foi com a Moema, sobre origem do citoesqueleto. Muito interessante, há proteínas semelhantes em procariotos que fazem "papel" de citoesqueleto, inclusive com conformações parecidas e origem evolutiva. Já a 2a parte, com a Alessandra, foi sobre a estrutura do citoesqueleto: ela abordou os 3 componentes do citoesqueleto, as moléculas que compõem cada filamento, proteínas acessórias, miogênese e miofibrilogênese (você sabe a diferença? Então me deixa um recado! Responderei nos próximos posts), importância de cada filamento do citoesqueleto. Foi um pouco corrido, pois estávamos com o tempo apertado, mas como a maioria das informações estavam na apostila, anotei só o necessário.

Componentes do citoesqueleto: microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários. À esq. imagens em MET.

À tarde, focamos nas técnicas de estudo das células - e como estudar citoesqueleto. Era a parte que mais me interessava. O Rubem é muito bom, e quando olhei no relógio já eram 15:40! (Começamos às 14:10h). Falamos desde microscopia óptica, um pouco do histórico, limite de resolução, objetivas, campo claro, contraste de fase, contraste de fase interferencial, confocal (finalmente entendi confocal!), MET, MEV, um pouco de criofratura e a novidade da M.E. de força atômica. Enfim, nesta parte tive a oportunidade de esclarecer todos as lacunas que eu tinha sobre técnicas (não fui muito feliz em bio geral, como muitos devem saber). E na 2a parte, a Mariana abordou os métodos utilizando imunofluorescência (mais uma vez muito esclarecedor): anticorpo(AC) primário, AC secundário, autofluorescência que o material pode emitir confundindo as análises (será que minhas céls tem isso?!), abordagens da marcação direta (a molécula que fluoresce, o fluorocromo, tá conjugada, quer dizer, ligada, ao AC primário) ou indireta (fluorocromo conjugado ao AC secundário), marcação com drogas (é o que faremos nas aulas práticas) e marcação por GFP.

Marcação por fluorescência. Em vermelho: actina; em verde: microtúbulos; em azul: núcleo

Este primeiro dia foi ótimo, muito bom, me ajudou a entender muita coisa que me confundia, que sabia só uns"pedacinhos", agora ganhei mais peças para completar o quebra-cabeça rs. Tá bom, ok, vamos lá, fiquei boquiaberta, não pensei que seria tão legal o citoesqueleto, em especial estudá-lo :)

Ah, para responder a pergunta não vale procurar no Google! ;)

Quando o equívoco se torna um acerto

Continuando do post abaixo, fiz o L-15 em pó. Na verdade, ele só estava na minha geladeira porque nosso representante Marco Aurélio se equivocou e me trouxe L-15 em pó, em vez de líquido. Quis trocar, mas o Mauro achou melhor ficarmos com o pó para mais tarde testarmos – além de ser uma grande economia: na embalagem vinham 10 vidros e cada um fazia 1L de meio! Confesso que fiquei descrente, como sempre. Vivia dizendo para mim mesma fazer o pó para assegurar que funcionava. Fui enrolando, enrolando... contudo percebi que chegara a hora. Calculei o peso do L-15 em pó para fazer 200mL de meio, pesei o HEPES para 25 mM (alguns artigos diziam 20, outros 25 mM...). Dissolvendo, ficou rosa, como imaginei, mas o pH estava mais baixo, 8,5 se não me engano. Fui adicionando HCl e voilà! Consegui chegar a 7,2!
Filtrei com o filtro pequeno, usando a seringa grande (deu trabalho!) e o líquido ficou praticamente da mesma cor que o comprado pronto.

L-15 em pó (esq) e o de garrafa (dir)

Agora faltava testar... Mas antes, gostaria de fazer um parênteses sobre a polilisina. Neste meio tempo de tentar acertar o HEPES, peguei na Silvana um pouco de solução de polilisina para testar, pois esse polímero ajuda na aderência das células. Testei em umas plaquinhas que não são muito boas e realmente a aderências das células foi maior com a poli-, tanto no controle como no Cádmio. Bom, muito bom... fecha parênteses.

Fiz plaquinhas para testar o meio novo. Senti bom sinal ao ver que o L-15 não ficou amarelado quando eu adicionei o Cd, o que significa que o pH se manteve estável. Após 24h, ao olhar no microscópio as células estavam ótimas, tanto controle quanto cádmio, muitas células aderidas. Chegou a hora da verdade: o vermelho neutro...tcham tcham...

CONTROLE: células ótimas, aderidas e muito pouco coradas. Há muito tempo que não via as células assim, citoplasma limpo, ou com alguns pequeninos lisossomos.
CÁDMIO: células aderidas e...coradas! Sim, finalmente as células não estavam mais com aqueles aspecto amarelado, redondas, elas estavam coradas, até havia algumas que não estavam. E havia mais células soltas do que o controle, como eu imaginei, umas coradas, outras não.

Vi uma célula especial, acho que do cádmio, com grânulos (eterna dúvida, grânulos ou lisossomos?) e um vacúolo enorme. Me distraí e quase perdi a hora do Praça XV! Deixei algumas coisas sobre a bancada (desculpa ju, eu arrumei no dia seguinte)desliguei tudo, tranquei a porta e saí correndo!

O problema do HEPES

No final deste post escrevi que o Mauro sugerira de um fazer HEPES que ficasse a uma concentração de 20 mM no L-15. Então, tive a idéia de fazer uma solução bem concentrada de HEPES para adicionar o menor volume possível ao L-15. Fiz os cálculos para 2 M, o que me faria adicionar algo em torno de 10 uL/mL ao meio.
Mas como sempre, tive problemas, e como sempre, tentei resolvê-los. Uma verdadeira Saga de Hades (rs)

1ª tentativa: a massa de HEPES a ser pesada era de 26g...para ser diluído em apenas 50 mL! Adicionei 40 mL em um béquer e vamos à diluição. No fim, o volume havia mudado para 60 mL! A Ju sugeriu de eu pesar mais um pouco para completar 75 mL de solução a 2 M. Deu certo. Agora, ajustar o pH: de 11 para 7,5. Pinga HCl. Pinga, pinga...nem sei o quanto de volume coloquei mas foi grande e nem chegou a 8,5! Desisti.

2ª tentativa: Diminuí a concentração para 1 M (o que reduz a massa para 13g, mantendo o volume de 50 mL) – agora não lembro se foi por causa do problema do volume ou do pH. Consegui diluir e avolumar para 50 mL. Hora de ajustar o pH. Desta vez eu medi no lab da Silvana, pois o nosso estava sem eletrodo.Continuou 11. Pinga HCl. Pinga...pinga...pinga...e o pH precisava estar em torno de 7,5, só que eu já tinha adicionado 4 mL de HCl e nem a 8 chegou. Mais uma vez, descarte, pois 4mL é um volume considerável e com certeza alterou a concentração da solução. Desisti.

3ª tentativa: Fiz novamenta a solução a 1M, mas desta vez usei o Ac nítrico CONCENTRADO (mais ou menos 80%) , direto da garrafa, para ajustar o pH, após longa conversa com o Mauro sobre grau de dissociação de um ácido. Vai para a capela com pHmetro de bancada, agitador magnético, luvas. E aconteceu como nas outras vezes: pinguei 80 gotas com a pipeta Pasteur (nas outras vezes usei micropipeta 1000uL). Achei muito e calculei o volume: 1 mL = 20 gotas, 80 gotas equivale a...4 mL... Desisti mais uma vez.

O que acontece é que o HEPES é um tampão, ou seja, ele não permite grandes variações de pH e sua faixa de tamponamento é de 7,5 a 8,5 mais ou menos. Ou seja, se a solução estiver nesta faixa, você pode pingar ácido ou base (quase) à vontade que o pH se mantém estável.
Procurei por protocolos no site protocol-online.org e fiquei surpresa ao ver que eles ajustavam o pH com NaOH! Como é possível, se a solução já estava básica? Pensei que fosse assim devido a alguma reação química do tipo íon comum, ou algo que desconhecia. Mas reparei que o HEPES usado por ele tinha peso molecular diferente do meu. Procurando nos catálogos de reagentes (eles não servem apenas para apoiar monitores de PC rs) vi que existiam dois tipos: Sodium Salt (o que eu tinha) e o Free Acid (que ao contrário do que pensei, não é livre de ácido, mas sim que libera ácido livre). E a diferença entre os dois era a presença de Na e ausência de H no Sodium Salt. Pronto, estava explicado, era esse o motivo.
Perguntei para a Tatiana (irmã da Ju) se ela tinha o HEPES free acid (que libera ácido) mas o que ela tinha era igual ao meu. No lab dela eles trabalham muito com culturas e conversando ela me disse que o HEPES é pesado junto com o meio em pó. Porém, meu meio era líquido e estéril. Por isso que eu queria uma solução concentrada...

Aceitei a sugestão dela e decidi fazer (após falar com Mauro, claro) o L-15 em pó que há meses está na geladeira.