sexta-feira, 4 de julho de 2008

O problema do HEPES

No final deste post escrevi que o Mauro sugerira de um fazer HEPES que ficasse a uma concentração de 20 mM no L-15. Então, tive a idéia de fazer uma solução bem concentrada de HEPES para adicionar o menor volume possível ao L-15. Fiz os cálculos para 2 M, o que me faria adicionar algo em torno de 10 uL/mL ao meio.
Mas como sempre, tive problemas, e como sempre, tentei resolvê-los. Uma verdadeira Saga de Hades (rs)

1ª tentativa: a massa de HEPES a ser pesada era de 26g...para ser diluído em apenas 50 mL! Adicionei 40 mL em um béquer e vamos à diluição. No fim, o volume havia mudado para 60 mL! A Ju sugeriu de eu pesar mais um pouco para completar 75 mL de solução a 2 M. Deu certo. Agora, ajustar o pH: de 11 para 7,5. Pinga HCl. Pinga, pinga...nem sei o quanto de volume coloquei mas foi grande e nem chegou a 8,5! Desisti.

2ª tentativa: Diminuí a concentração para 1 M (o que reduz a massa para 13g, mantendo o volume de 50 mL) – agora não lembro se foi por causa do problema do volume ou do pH. Consegui diluir e avolumar para 50 mL. Hora de ajustar o pH. Desta vez eu medi no lab da Silvana, pois o nosso estava sem eletrodo.Continuou 11. Pinga HCl. Pinga...pinga...pinga...e o pH precisava estar em torno de 7,5, só que eu já tinha adicionado 4 mL de HCl e nem a 8 chegou. Mais uma vez, descarte, pois 4mL é um volume considerável e com certeza alterou a concentração da solução. Desisti.

3ª tentativa: Fiz novamenta a solução a 1M, mas desta vez usei o Ac nítrico CONCENTRADO (mais ou menos 80%) , direto da garrafa, para ajustar o pH, após longa conversa com o Mauro sobre grau de dissociação de um ácido. Vai para a capela com pHmetro de bancada, agitador magnético, luvas. E aconteceu como nas outras vezes: pinguei 80 gotas com a pipeta Pasteur (nas outras vezes usei micropipeta 1000uL). Achei muito e calculei o volume: 1 mL = 20 gotas, 80 gotas equivale a...4 mL... Desisti mais uma vez.

O que acontece é que o HEPES é um tampão, ou seja, ele não permite grandes variações de pH e sua faixa de tamponamento é de 7,5 a 8,5 mais ou menos. Ou seja, se a solução estiver nesta faixa, você pode pingar ácido ou base (quase) à vontade que o pH se mantém estável.
Procurei por protocolos no site protocol-online.org e fiquei surpresa ao ver que eles ajustavam o pH com NaOH! Como é possível, se a solução já estava básica? Pensei que fosse assim devido a alguma reação química do tipo íon comum, ou algo que desconhecia. Mas reparei que o HEPES usado por ele tinha peso molecular diferente do meu. Procurando nos catálogos de reagentes (eles não servem apenas para apoiar monitores de PC rs) vi que existiam dois tipos: Sodium Salt (o que eu tinha) e o Free Acid (que ao contrário do que pensei, não é livre de ácido, mas sim que libera ácido livre). E a diferença entre os dois era a presença de Na e ausência de H no Sodium Salt. Pronto, estava explicado, era esse o motivo.
Perguntei para a Tatiana (irmã da Ju) se ela tinha o HEPES free acid (que libera ácido) mas o que ela tinha era igual ao meu. No lab dela eles trabalham muito com culturas e conversando ela me disse que o HEPES é pesado junto com o meio em pó. Porém, meu meio era líquido e estéril. Por isso que eu queria uma solução concentrada...
Aceitei a sugestão dela e decidi fazer (após falar com Mauro, claro) o L-15 em pó que há meses está na geladeira.

4 comentários:

Juliana Americo disse...

E...????
Poxa, vai me deixar na curiosidade? Quero saber o resultado do ensaio de VN com o meio com hepes!
Quando vc estava fazendo as soluções de hepes, era melhor ajustar o pH antes de avolumar a solução para o volume final, aí o volume de HCl adicionado não ia atrapalhar.
Vou esperar o post sobre o VN :)
Bjs

Eliane, a Lia disse...

sim, eu ajustei o pH antes de completar até o vol. final. isso eu aprendi direitinho rsrs

Júlio César Ribeiro disse...

Eliane, eu trabalho com culturas celulares, sugiro que faça a solução do Hepes normalmente, não importa o ph, filtre em membrana Millipore 0,25u , e acrescente no
L15. Após ajuste o ph final do meio com NaoH 1 N estéril. Vai funcionar.
Júlio César Ribeiro

Eliane, a Lia disse...

Olá Júlio César!
no post seguinte, eu consegui resolver esse pepino. Pesei o L15 e pó e o HEPES e solubilizei tudo junto. Em seguida, medi o pH e depois usei um filtro 0,2 micrômetros para esterilizar. Voilà! Temos L15 tamponado com HEPES. Obrigada pela força!